发布时间 : 星期五 文章多靶点pCRISPR载体(汇编)更新完毕开始阅读fb6d263f588102d276a20029bd64783e09127d49
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CRISPR-derived genome editing technology
A pYLCRISPR/Cas9-MT(II) vector system for targeting mμltiple
gene sites of dicot plants
华南农业大学 刘耀光实验室
1. CRISPR-Cas9核酸酶切靶序列原理图示：
Cas9 nucleaseRuvC-like domainHNH domainTarget Site PAMNGGNNNNNNNNNNNN-3’genome NCC NNNNNNNNNNNN-5’sequence5’ NNNNNNNNNNNN3’ NNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCleavage siteNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN5’-G/ANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAgRNAAAACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUUCGAUAGAACGUGGCUCUUGAAAAAGUGGCACCGAGUUUUU-3’
2 相关载体图谱
2.1 CRISPR—gRNA vector：
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BsaIgRNASpeITTTTTTPAtU6BsaIPAtU6=Arabidopsis U6 promoterBsaI酶切方式:ggtctcNNNNNNN-33-ccagagNNNNNNNSpeIpU6-gRNA (4kb)AmpR+ KanR（基于pEasy-Blunt载体）BsaITranscription initiation site (G) of U6 promoterPAtU6BsaIpEasy-Blunt载体骨架ATTGagagaccNNNNNN------------NNNNNggtctcaGTTTgRNABsaI注：用载体骨架隔开U6启动子和gRNA区，可以避免没有被BsaI切断的空载分子被PCR扩增，见后面说明
2.2 CRISPR双元载体 (双子叶植物用，也可用于单子叶植物，但pYLCRISPR/Cas9-MT(I)更合适单子叶植物)
大肠杆菌致死基因5’-ctGCCGaGAGACCccdBGGTCTCAGTTTTA-3’BL’B1NLS (核定位信号）BsaIP35SAscIBsaINotIAscIT35sNotIpCas9ccdBpVS1repliconRBNotIP35:HPTLB
pYLCRISPR/Cas9-MT(II)(E.coliTOP10F’ (LacIq)KanrpBR322 oripBR322 born3. 基因组靶位点选择和双链接头设计
3.1 靶位点选择
（1）在目标区如果能够找到NGG上游第20碱基是A（用U3启动子）或G(用U6启动子）的序列（ (U3或U6启动子转录起始碱基），优先选为靶序列
19nt如果这里存在4碱基酶切位点，有利于检测打靶效果PAM5-NNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNN-3G靶位点19nt正向接头引物19nt精品文档
5-ggcANNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’反向互补接头引物5-gccGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’精品文档
合成接头的形式（U3启动子右上，U6a启动子右下） 注意：接头的2个粘性末端不互补
(2) 如果在NGG上游第20碱基不是A或G，可选20碱基为靶序列（Kabin Xie and Yinong Yang， 2013， Molecular Plant)
PAM5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNN-320nt20nt5-gccGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-33-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5合成接头的形式（U6a启动子）
为了提高突变效率，对一个目的基因设计多个靶点。建议在ORF 5’区和中部区域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。
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几个靶位点设计例：
起始密码PAMTTGCGAGCGAGATCGAGCGATGGCGACGGGG-3Cas9切点外显子切点TAAGAGCATAAGAACGGCGTTAAAAGGGTATGATAATGCAGTATGGTTA-3内含子左图：切点在起始密码附近或尽量在ORF上游，或在特定的功能域 (可能引起密码子缺失和移码)
右图：切点在外显子末端或前端（可能引起移码，或内含子识别位点缺失使内含子不被剪切）
特异性检查：虽然对植物基因打靶的特异性不是重要的问题（万一有负面作用的脱靶发生，与原受体亲本杂交就可排除），但应该将候选靶序列+NGG（5’端加几十碱基）对目标基因组做Blast，避免在靶序列3’端+NGG与其它功能基因有高相似性。但是打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基因时，就选择几个目标基因完全相同的区域为靶位点。
3.2 靶位点接头设计例
ForU3-gRNAExonborderIntron5’-ggcAaggatgggggcacttacca-3’3’-tcctacccccgtgaatggtcaaa-5’5’-gccGaggatgggggcacttacca-3’3’--tcctacccccgtgaatggtcaaa-5’5’-gttGaggatgggggcacttacca-3’3’--tcctacccccgtgaatggtcaaa-5’5’-tcaGaggatgggggcacttacca-3’3’--tcctacccccgtgaatggtcaaa-5’5’-gcctacggccatggtaagtgcccccatcctcttctacccctttgattt-3’3’-ggtaccattcacgggggtaggag-5’PAM20bpForU6a-gRNAForU6b-gRNAForU6c-gRNA
4. 多靶点pYLCRISPR/cas9-MT(II)载体构建
4.1 gRNA表达盒构建示意图（三靶点为例）
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