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cDNA基因文库的构建
2009-10-11 17:56:18| 分类： 生命科学|举报|字号 订阅
一、cDNA文库的特征和发展：
cDNA (complementary DNA):以mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成的与之反向互补的DNA链(单链cDNA，反义链)，以单链cDNA为模板还可以合成其反向互补链(取代mRNA的DNA链，正义链)，得到双链cDNA。
将生物某一组织细胞中的总的mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA，然后连接到合适的载体上，并转入宿主细胞。这种方法所形成的所有克隆的集合体叫cDNA文库。
1）cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。
2）cDNA一般较短，平均长度1.5kb左右，多数为100bp至10kb。 3）表达谱的时空动态性决定了cDNA文库的多样性。 4）不同基因的cDNA间存在丰度上的差异。 二、cDNA文库的构建： 1、RNA的分离
mRNA是构建cDNA文库的起始材料。总RNA中绝大多数是tRNA和rRNA，而mRNA只占总RNA的1﹪-5﹪，平均为2%，mRNA的比例取决于细胞类型和细胞的生理状态。由于mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库的一个重要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大提高筛选到目的基因的可能性。利用Poly(A)尾巴纯化或直接提取mRNA。 1）根据研究目标合理选择器官、组织和细胞类型以及合理的环境条件，用于提取RNA。
2）保持mRNA的完整性，是构建全长cDNA文库的核心。
3）选取合适的提取方法，除完整性外，mRNA还要求纯度高、DNA污染少，最好是采用无RNase的DNase去除杂质DNA。
4）RNA定量准确，保存合理。
5）根据目标和条件决定是否需要纯化mRNA或直接使用总RNA。 2、第一链cDNA的合成
由mRNA到cDNA的过程称为反转录(reverse transcription,RT)，由反转录酶(reverse transcriptase, RTase)催化。反转录酶是依赖RNA的DNA聚合酶，合成DNA是需要引物引导。常用的引物有：
oligo(dT)引物：在反应体系中加入高浓度的oligo(dT)引物， oligo(dT)引物与mRNA 3’末端的poly(A)配对，引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA，反转录的是整个表达谱，可以产生全长cDNA，应用最广。
随机引物：与mRNA分子内的多处配对，从多个位置合成cDNA第一链，反转录的几乎是整个表达谱，最多只能产生近全长cDNA，适合于得到总cDNA的5’末端。
基因特异引物(gene-specific primer, GSP)：仅反转录特定目标基因cDNA的5’末端。
有AMV和MMLV两种RTase，最适温度分别为42℃和37℃，需要敲除其RNase H活性，较高温度反转录有利于打开mRNA的二级结构，得到全长cDNA。 反转录过程中要防止mRNA降解，可以添加RNase抑制剂。 3、第二链cDNA的合成
cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂交双链变成互补双链cDNA的过程。 4种cDNA第二链合成的方法：
自身引导合成法：解离的cDNA第一链的3’末端会产生一个发夹状结构，可以引导第二链的合成，然后用S1核酸酶处理去除发夹结构。得到的5’不完整，且S1核酸酶处理不好控制，易导致cDNA的丢失，所以该法现已少用。 置换合成法：RNase H、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、DNA连接酶联合处理，得到近全长cDNA，5’缺失短序列。
引导合成法：利用末端转移酶在cDNA第一链的3’末端加上poly(dC)尾巴，利用poly(dG)为引物引导第二链合成，利用同源多聚尾与载体进行重组。
引物-衔接头合成法：引导合成法的改进型，在反转录引物和poly(dG)引物的5’引入优化设计的人工接头，可用PCR扩增广大总cDNA，也为总cDNA与载体的连接提供了酶切位点。
4、双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖
反转录和第二链合成过程中为cDNA两端引物合理的人工接头序列是关键（试剂盒），可以方便定向克隆和克隆子的处理。
总cDNA的分级分离：采用排阻层析柱，去除过大和过小的cDNA分子，保留500bp至8kb的总cDNA，以提高连接后文库的质量。 三、cDNA文库的均一化处理 1、基因组DNA饱和杂交法
mRNA水平上，基因之间丰度差异极大。 基因组水平，基因之间拷贝数差异不大。
将随机打断的基因组总DNA片段标记为探针，与总cDNA单链饱和杂交，弃除未杂交的总cDNA，从cDNA-DNA杂交体上变性释放除均一化后的总cDNA，转化宿主。
优点是简单，缺点是易导致部分基因cDNA的丢失。 2、基于复性动力学原理的均一化处理
二次复性动力学原理(second-order kinetcs)：浓度大的组分复性所需时间短，浓度越小复性越迟。
控制复性时间，用羟基磷灰石柱将单链和双链cDNA分开，保留单链cDNA后转化宿主。
优点是基因丢失较少、均一化效果好，缺点是操作难度大。 四、扣除杂交cDNA文库
利用分子杂交原理，去除非差异表达基因的cDNA，保留差异表达的基因的cDNA用于制备文库。
tester: 待测样本的总cDNA。
driver: 表达谱背景一致但不含目的基因的总cDNA。
tester与过量的driver杂交，用特定方法将二者共同表达的cDNA去除。 1、抑制性扣除杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)
为Clontech公司的专利试剂盒原理，将tester打上两组特定设计的接头，分别与过量driver进行第一轮杂交，然混合两种杂交体系进行第二轮杂交，通过PCR法特异扩增差异表达基因的cDNA，特定接头会通过锅柄结构而抑制非差异表达基因的PCR扩增。
2、mRNA-cDNA杂交：过量的驱动总mRNA与总cDNA杂交，利用生物素磁珠法将公共表达基因去除。 五、全长cDNA文库
cDNA不完整的原因：mRNA的降解、第二链合成中DNA聚合酶的外切核酶活性、反转录酶的特性的RNase H活性、反转录酶与mRNA模板的脱离(主要受mRNA复杂结构影响)。
1、SMART全长cDNA文库的构建方法
为Clontech公司的专利试剂盒原理，应用广泛，其独特的反转录酶具有末端转移酶活性， RTase自动在反转录得到的全长cDNA第一链的3’末端加上oligo(dC)，利用具oligo(dG)的接头引导第二链的合成。由于oligo(dC)比较短，因此较短的oligo(dG)容易介导合成假全长cDNA。 2、Cap-Trapper法构建全长cDNA文库
在mRNA的两端均打上生物素标记，合成cDNA第一链时用dm5 CTP代替dCTP，用RNaseⅠ消化单链RNA。 3、烟草酸性焦磷酸酶法构建全长cDNA文库
Invitrogen公司的试剂盒原理，首先利用碱性磷酸酶处理使非全长mRNA无效化。用烟草酸性焦磷酸酶(tobacco acid pyrophosphatease, TAP)处理以移去全长mRNA的帽子结构，然后为脱帽后的全长mRNA的5’末端接上人工接头，利用具oligo(dT)的人工接头进行反转录，得到的全长cDNA第一链的两端就打上了特别设计的人工接头，可用PCR法对全长总cDNA进行放大，酶切后与载体连接。
优点是理论上全部cDNA都将是全长，缺点是操作的技术性强。
六、其它cDNA文库
表达cDNA文库：用表达载体构建全长cDNA文库，文库的每一个克隆子可以表达出蛋白，利用蛋白对克隆子进行筛选。
双杂交全长cDNA文库：将表达文库与酵母双杂交系统结合使用，利用酵母作宿主，通过融合蛋白的酵母双杂交对克隆子进行筛选，用于鉴定可与特定蛋白相互作用的基因，主要为转录因子。
重组酶克隆策略的cDNA文库：将重组酶的特异识别序列attP1和attP2构建到每个cDNA的两端，在非消化情况下实现与载体的重组连接，避免了基因被切断。