发布时间 : 星期一 文章质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳更新完毕开始阅读ecc8f6d7a9114431b90d6c85ec3a87c241288ac3
碱基之间的平面基团，DNA与之结合后在紫外线照射下呈现荧光。
实验室中最常用的荧光染料是溴化乙锭（EB）。其原理是在紫外线照射时，核酸的吸收波长为254nm的紫外线并将能量传递给溴化乙锭，同时嵌入在核酸碱基间的溴化乙锭吸收302nm和366nm波长的紫外线，来自两方面的能量最终激发出波长为590nm的红橙色的可见荧光。通常用水将EB配制成l mg/mL的贮存液，于室温下避光保存。该染料通常以0.5 μg/mL的浓度掺人到凝胶和缓冲液里，电泳后直接观察。也可在不加EB的条件下进行凝胶电泳，电泳完成后将凝胶浸在含EB(0.5 μg/mL)的电泳缓冲液或水中，于室温下染色20 min左右后观察。EB的存在将使线状双链DNA的电泳迁移率降低近15％。应该注意的是，溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用这种染料的溶液时务必带上防护手套。如不慎与皮肤接触，应立即用清水彻底冲洗，含有溴化乙锭的溶液在使用后，不得随意丢弃。
出于安全性的考虑，本实验对凝胶的染色未采用溴化乙锭，而是选择了更加安全低毒的GoldViewTM核酸染料。它是一种新型的核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。
经过荧光染料染色后的凝胶，在暗室条件下，经过紫外灯照射激发可以出现相应的可见荧光。实验者可通过肉眼或仪器进行观察，紫外线投（反）射仪原理如图。随着科技的发展，各种自动化很高的相关仪器，设备相继问世。这些先进仪器的使用使得测量结果更加接近真实值，凝胶扫描仪和图像分析系统就是具有代表性的仪器。凝胶扫描仪主要用来对样品单向电泳后的区带进行扫描，从而得出定量的结果。凝胶扫描仪的出现大大缩短了电泳结果的分析时间，更主要的是提高了电泳结果分析的准确性。扫描仪所得的图谱通过计算机进一步进行数据加工处理，提高了数据的分辨率、准确度和灵敏度，特别是在背景扣除、积分方法等数据处理上可以根据情况来选定，从而使得测量结果与真实情况更加接近。而图像分析系统将凝胶谱图摄制下来，进一步将信息数字化，同时输入到计算机中再进行分析，使测定结果更加迅速、精确。现在的凝胶成像以及图像分析系统不但可以做蛋白质定量，而且也可以做荧光和放射自显影测量，大大地推动了分子生物学的研究进展。凝胶扫描仪的原理和结构与分光光度计基本一致。其结构分为光源、单色器（或滤光片）、样品室、光电倍增管、结果显示等几部分。样品室是为专门放置凝胶板而设计的。根据设置的不同光源，扫描仪可有不同的功能，如为紫外光源，可以扫描未经染色的凝胶。而采用可见光源的扫描仪只能对于染色凝胶进行检测。根据扫描仪视光路的不同，有透射方式测定和反射方式测定两种，前者能扫描可以透光的凝胶，而后者因光束方向可以改变，则可以扫描不透明的电泳转移膜、层析板等。
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2.4大肠杆菌及质粒载体
大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）是革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。它的主要特点有以下几点：1、大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。2、大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。3、人体与大肠杆菌的关系：在不致病的情况下（正常状况下），可认为是互利共生（一般高中阶段认为是这种关系）；在致病的情况下，可认为是寄生。4、培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。5、大肠杆菌在生物技术中的应用：大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。6、大肠杆菌在生态系统中的地位，假如它生活在大肠内，属于消费者，假如生活在体外则属于分解者。7、它的基因组DNA为拟核中的一个环状分子。同时可以有多个
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环状质粒DNA。TOP10菌株属于大肠杆菌，它适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
质粒载体pET系统可以使各种目的蛋白得以最优化表达。受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上，但非充分诱导时，能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定。
3 实验材料
3.1 主要器材
电子天平，冰箱，超净工作台，摇床，高速离心机，旋涡振荡器，制冰机，微量移液器，微量离心管，微波炉，琼脂糖凝胶电泳仪（DYY-6C型，北京市六一仪器厂），紫外凝胶成像系统（DNR Bio-Imaging Systems），封口膜，一次性手套。
3.2 主要试剂
(1)
菌种：含有PET28a质粒的大肠杆菌Top10，卡纳霉素抗性。含有pUC18质粒的大肠杆,菌氨苄青霉素抗性。 (2) (3) (4)
LB液体培养基：酵母浸膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0 卡纳霉素：100 mg/mL
Plasmid mini kit质粒小量提取试剂盒（Biomiga公司）
(5) 琼脂糖：电泳级
(6) DNA Marker IV，由6条线状双链DNA条带组成，分别为7000、5500、3500、
2000、1000和500bp
(7) GoldViewTM核酸染料（赛百盛）
(8) TAE溶液：40 mmol/L Tris-乙酸盐，1 mmol/L EDTA (9) 10×点样缓冲液（Loading Buffer, Takara）
4 实验方法
4.1菌体培养（前期准备工作）
将50μL甘油中保存的菌液接入固体LB平板37②过夜培养，挑取单菌落接入10mL液体LB培养基（其中卡纳霉素的浓度为50 ug/mL），37②，200rpm过夜培养。
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4.2质粒提取
按照Plasmid mini kit质粒小量提取试剂盒（Biomiga公司）进行操作：
1. 37℃过夜培养的菌液1~4 mL 13000 rpm离心1 min，收集菌体，并尽可能的去除上清，以防止后面菌液裂解不充分和沉淀不完全的情况；
2. 使用250 μl Buffer A1充分重悬沉淀；
3. 加入250 μl BufferB1后反转离心管使液体混合均匀，然后静置4 min，最好出现溶液粘稠且澄清的现象，否则可以考虑加大B1的量或者减少菌液的量；
4. 加入350 μl 冰箱预冷的Buffer N1后立即反转多次至溶液充分混匀，出现白色絮状沉淀后放置于冰浴上静置2min；
5. 室温下13000 rpm离心10 min，一次到多次直至上清中没有沉淀为止，然后将上清转入带有已平衡好的DNA柱中，放置于收集管中室温下13000 rpm离心1 min，，重复两次后弃滤液；
6. 向DNA柱中加入500 μl Buffer KB，室温13000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中的滤液；
7. 向DNA柱中加入500 μl DNA Wash Buffer，13000 rpm室温离心1 min，重复两次后弃滤液；
8. 开盖后室温13000 rpm离心5min，或者置于超净台中风干残留的乙醇，以保证最后的洗脱效率；
9. 将纯化柱置于新的1.5 ml离心管中，加入50μl预热的Elution Buffer。室温下放置2 min后13000 rpm离心1 min，重复两次后，收集洗脱液。
10. 测定得到的纯化产物的浓度，保存于-20℃冰箱中待用。
4.3 琼脂糖凝胶电泳
A 制胶
a) 利用1×TAE溶液配制1.0%琼脂糖25ml(浓度由目的条带大小决定)，微波加热
使之溶化；
b) 加入2.5μL GoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡；
c) 将制胶床放入水平放置的制胶托盘中，插好梳子，倒入融好的琼脂糖凝胶； d) 待凝胶充分凝固(30min)后，拔下梳子。 B 加样
e) 将制胶床连同凝胶一起放入电泳槽中；
f) 加入电泳缓冲液TAE，浸没胶面1mm左右；
g) 10μL的样品和2μL点样缓冲液在封口膜上混和，然后点在点样孔中； h) 将4μL 的DNA Marker点在点样孔中。 C 电泳
i) 盖上透明上盖；
j) 接通电源线，选择工作电压，120V，30min，打开电泳开关；
k) 当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源，将
凝胶在紫外灯下观察，并用凝胶成像系统成像保存电泳图。（请注意观察，如溴酚蓝已经接近另一端时可及时停止）
l) 如需要进行切胶回收，需要尽量保证目的DNA片段暴露在紫外灯下的时间比
较短。
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