发布时间 : 星期一 文章刘耀光 - 多靶点pCRISPR载体（单子叶和双子叶植物用）使用方法2015-4-14(new)(1)更新完毕开始阅读dd760fb486868762caaedd3383c4bb4cf7ecb71d
19ntPAM5-NNNNNNNNN(A/G)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNN-3target19nt合成接头的形式：5-ggcANNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(forward adaptor primer, T#-F)（对OsU3启动子）3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’(reverse adapter primer, T#-R)
常规靶点（regular target）接头（target adaptor）的形式
注：接头正向引物T#-F和反向引物T#-R命名是根据靶点在sgRNA表达盒的连接方向决定，不是基因方向决定，否则这些引物用于检测阳性克隆时容易搞错方向; 另外注意设计引物（尤其反向引物）时的5’-3’方向。
（2）如果NGG上游第20碱基不是A或G，作为非常规靶点(irregular target)，将20碱基为靶序列合成接头的形式
PAM5-NNNNNNNNN(T/C)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNN-320nt合成接头的形式：5-gtcA(T/C)NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3（对AtU3b启动子）3-(A/G)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5非常规靶点（irregular target）接头的形式
也就是说，所用启动子的转录起始点与NGG上游第20碱基相同的regular靶点就是合成19碱基+4碱基粘性末端(转录产生的靶点配对序列为A/G+19 =20)；不相同的irregular靶点就是合成20碱基+4碱基粘性末端。
对使用拟南芥的AtU3/AtU6启动子的靶点接头也是同样道理，但对接各启动子的粘性末端不同（见Figure 3B）。
20nt
3.3 Overlapping PCR法扩增sgRNA表达盒引物设计 见4.1.2（与3.2相同目的，自由选择用任一个方案）
4. pYLCRISPR/Cas9打靶载体构建原理
4.1靶点引物接头与sgRNA表达盒的连接和扩增
4.1.1 sgRNA构建方法1 (接头连接扩增法，与3.2对应)：
连接接头后（连接操作见步骤5-5），有3种方法扩增sgRNA表达盒片段（Figure 4）：
（1）直接用Golden Gate位置特异引物(Table S1)做一轮PCR扩增。此方案效果不那么稳定，且不能避免扩增下图的产物IV和产物V。
（2）做2轮巢式PCR，第一轮PCR用通用的U-F/gR-R做1个反应（引物序列见附录），第二轮PCR用位置特异引物扩增。此方案扩增效果好且稳定，但同样不能避免扩增产物IV和产物V（注1）。
（3）做2轮巢式PCR，第一轮PCR做2个反应，分别用U-F/接头反向引物，和用接头正向引物/gR-R；第二轮为Overlapping PCR,用位置特异引物扩增出表达盒产物。虽然此方案第一轮PCR需要做2个反应，但效果最好且能避免扩增产物IV和产物V，因此推荐使用此方法。
Figure 4．Generation of a sgRNA expression cassette by adaptor-ligation and PCR amplification
在第一轮PCR加热过程中（73-75度），有缺口的引物（Tm值低于U3/6和sgRNA序列）先解离， U3/6和sgRNA序列3’端（未解离）立即延伸补平，产生接头引物互补结合位点。
注1:为了提高接头连接效率，本操作中使用较高浓度（0.05 μM）的靶点接头，实际上大部分产生线性单端连接(产物II, III)，而环状(双端)连接(产物I)较少。另外，过度酶切，星活性，过度连接等都可能产生破坏的平滑末端，有可能连接产生双接头产物或的空载产物（产物IV和产物V）。
4.1.2 sgRNA构建方法2 （以Overlapping PCR 往sgRNA表达盒导入靶序列）
这种方法不需要用Bsa I切sgRNA质粒和连接反应，更加简便，不会产生上述的产物IV和V。即设计
的2条靶点引物3’端有15-17 nt分别与U3/U6启动子和sgRNA配对，用PCR扩增出片段后进行第二轮overlapping PCR。
Target sequence (+)U-FU3/U6promoterVector backbonegRT#+sgRNAregion1stPCRgR-RU#T#-1stPCRTarget sequence (-)Take 0.2 ml 2ndPCR (overlapping PCR)AnnealingBsaIPpsExtensionPCRBsaIBsaI PgsBsaI
Figure 5. Procedures for generation of a sgRNA expression cassette containing a target sequence by overlapping PCR. The chimeric primers with target sequence strands are given in Table S2. The first PCR can be carried out in two separated reactions with U-F/U#T#- and gRT#+/gR-R primer pair, respectively, or in one reaction with the all 4 primers. U# indicates a given promoter, and T#+ and T#- indicate strands of a target sequence.
引物设计例子靶点第1碱基与转录起始碱基相同(regular target)Target sequence转绿起始点GTCGGCCGGCAGCCGGATGACGG19 ntgRT#+TCGGCCGGCAGCCGGATGAgttttagagctagaaat-3（下划线与sgRNA配对）(#为靶点特异编号)OsU6aT#-OsU6bT#-OsU6cT#-TCATCCGGCTGCCGGCCGACggcagccaagccagca-3（下划线与OsU6a 配对）TCATCCGGCTGCCGGCCGACaacacaagcggcagc-3（下划线与OsU6b 配对）TCATCCGGCTGCCGGCCGACtgagcctcagcgcag-3（下划线与OsU6c 配对）TCATCCGGCTGCCGGCCGATgccacggatcatctgc-3（下划线与OsU3 配对）Target sequenceACAACACGACGACGTCGCCTCGGgRT#+OsU3T#-CAACACGACGACGTCGCCTgttttagagctagaaat-3AGGCGACGTCGTCGTGTTGTgccacggatcatctg（下划线与OsU3 配对）靶点第1碱基与转录起始碱基不相同(irregular target)TGGCAAGGAGTTCCGTTCCTCGGgRT#+OsU6aT#-TGGCAAGGAGTTCCGTTCCTgttttagagctagaaat-320 ntAGGAACGGAACTCCTTGCCACggcagccaagccag-3OsU6b, OsU6c, OsU3 的配对碱基与上面相同
4.4靶标gRNA表达盒排列和扩增引物使用方法
本系统目前使用水稻来源的4个small nuclear RNA启动子的表达水平为OsU6a>OsU6b >OsU6c > OsU3a。但打靶成功效率好像与sgRNA的表达水平没有明显的相关性(即在水稻sgRNA水平不是限制性因素)。当连接靶点多于4个时，为了降低相同启动子序列在农杆菌发生同源重组的可能性，使相同启动子间的距离尽量近（2个相邻的同向重复序列间能够发生同源配对的碱基对数少于该重复序列长度的1/2）。因此建议U3、U6a~c启动子的使用和排列方式为：
1个靶点：LacZ-U6a
2个靶点：LacZ-U6a—U6b
3个靶点：LacZ-U6a—U6b—U6c
4个靶点：LacZ-U6a—U6b—U6c—U3
5个靶点：LacZ-U6a—U6a—U6b—U6c—U3
6个靶点：LacZ-U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U3
7个靶点：LacZ-U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U6c—U3
8个靶点：LacZ-U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U6c—U3—U3
注：由于靶点接头5’端4个碱基形成的粘性末端是根据使用的不同启动子而不同，要注意其对应关系。
sgRNA表达盒特定位置引物对的使用方法(T1，T2为靶序列；U#为各启动子)：
1 cassette: Pps-GGL/Pgs-GGR;
扩增相应的U#-T1-gRNA
2 cassettes: Pps-GGL/Pgs-GG2, Pps-GG2/Pgs-GGR;
扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA;