发布时间 : 星期二 文章木瓜蛋白酶活力测定方法更新完毕开始阅读d8ba123343323968011c924a
（5）将4支试管置另一个40℃士0.5℃恒温水浴中保温15min，再向各管分别加入40 ℃下预热的1％淀粉溶液2m1，摇匀，立即放入40℃恒温水浴准确计时保温5min 。取出后向测定管迅速加入4ml0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。 3.淀粉酶总活力测定
取酶液5ml，用蒸馏水稀释至100m1，为稀释酶液。另取4支试管编号，2支为对照，2
支为测定管。然后加入稀释之酶液lml。在对照管中加入4m10.4mol氢氧化钠。4支试管中各加1
mlpH5.6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复α-淀粉酶测定第（5）步的操作，同样准备测糖。
4.麦芽糖的测定
（1）标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。分别加入麦芽糖标准液（lmg/ml）0,
0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml
，再各加3，5一二硝基水杨酸试剂2.0m1，置沸水浴中加热5min。取出冷却，用蒸馏水稀释至
25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（
mg）为横坐标，绘制标准曲线。
（2）样品的测定取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml 具塞刻度试管中，各加入2m13,5-
二硝基水杨酸试剂。以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。
（A—A0）xVT 五、结果处理
式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（mg）； Ao为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（mg）；
B为（a十β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（mg）； Bo为（a十β）淀粉酶的对照管中麦芽糖（mg）； VT为样品稀释总体积（ml）； VU为比色时所用样品液体积（ml）； W为样品重（g）。 六、注意事项
（1）酶反应时间应准确计算。 （2）试剂加入按规定顺序进行。 七、思考题
1.淀粉酶活性测定原理是什么？
2.酶反应中为什么加pH5.6的柠檬酸缓冲液？为什么在40℃进行保温？ 3.测定酶活力，应注意什么问题？
一、目的
淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6
糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。
淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。因此，淀粉酶的活性测定，具有理论和应用研究的意义。通过本实验，学习酶活测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。
二、原理
淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-
酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶和 β-淀粉酶。
α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α
-极限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH3.6 以下可使其钝化。
β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1,6
键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl—
等辅助因子，最适pH偏酸，与α-淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70℃保温15min 可使其钝化。
通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70 ℃加热15min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出
β-淀粉酶活力。
淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的
3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5- 硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。 三、仪器、试剂和材料 1.仪器
（1）电子顶载天平 （2）研钵
（3）容量瓶100mL2个
（4）具塞刻度试管25Ml15支 （5）试管8支
（6）吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支 （7）离心机 （8）离心管 （9）恒温水浴锅 （10）分光光度计 2.试剂
（1）1%淀粉溶液
（2）0.4mol/L氢氧化钠
（3）pH5.6柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g，溶解后定容至1000mL，为A
液。称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000mL，为B液。取A液13.7mL与B液 26.3mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。
（4）3,5-二硝基水杨酸精确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L
氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至
100Ml
，盖紧瓶塞，防止CO2进入。
（5）麦芽糖标准液（1mg/ml）称取0.100g麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100mL。 3.材料
萌发3天的小麦芽。 四、操作步骤 1.酶液提取
称取2g萌发3天的小麦种子（芽长1cm左右），置研钵中加少量石英砂和2m1
左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100m1容量瓶中，用蒸馏水定容至100m1，每隔数分钟振荡1
次，提取20min。3000r／min离心l0min，转出上清液备用。 2.a-淀粉酶活力测定
（1）取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。 （2）于每管中各加酶液lml，在70℃士0.5℃恒温水浴中准确加热15min，钝化β -淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。
（3）在对照管中加入4m10.4mol/L氢氧化钠。
（4）在4支试管中各加入1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。 （5）将4支试管置另一个40℃士0.5℃恒温水浴中保温15min，再向各管分别加入40 ℃下预热的1％淀粉溶液2m1，摇匀，立即放入40℃恒温水浴准确计时保温5min 。取出后向测定管迅速加入4ml0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。 3.淀粉酶总活力测定
取酶液5ml，用蒸馏水稀释至100m1，为稀释酶液。另取4支试管编号，2支为对照，2
支为测定管。然后加入稀释之酶液lml。在对照管中加入4m10.4mol氢氧化钠。4支试管中各加1
mlpH5.6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复α-淀粉酶测定第（5）步的操作，同样准备测糖。
4.麦芽糖的测定
（1）标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。分别加入麦芽糖标准液（lmg/ml）0,
0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml
，再各加3，5一二硝基水杨酸试剂2.0m1，置沸水浴中加热5min。取出冷却，用蒸馏水稀释至
25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（
mg）为横坐标，绘制标准曲线。
（2）样品的测定取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml 具塞刻度试管中，各加入2m13,5-
二硝基水杨酸试剂。以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。 （A—A0）xVT 五、结果处理
式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（mg）； Ao为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（mg）；