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体外合成mRNA(3天法)
首先，使用Not1线性化含目的基因的质粒，然后使用mRNA合成试剂盒（mMESSAGE mMACHINE kit; Ambion, Inc.）合成mRNA。 具体步骤为：
(1) 酶切获取线性化模板
合mRNA前，用Not1（或其他内切酶）线性化质粒（一般100uL反应体系），37℃，酶切过夜； （2）DNA模板抽提纯化
1）加DEPC水补齐至400uL；（+300uLDEPC水）（RNA超净台中）
2）加入等体积（200uL+200uL）酚：氯仿：异戊醇（25：24:1）；剧烈振荡5min，静置2-5min；
3）4℃，12,000rpm,离心15min；
4）小心吸取上清（注意不要吸到中层和下层），加入40uL(即0.1倍上清体积)NaAc(3M,pH 5.2)+1mL(即2.5倍体积上清)冷无水乙醇，颠倒混匀，-20℃过夜或者-80℃至少2h(通常-40℃过夜)； 5）次日,4℃，13,000rpm,离心15min；
6）弃去上清（尽量吸干净），沉淀为所需样品，使用1mL 75%乙醇（DEPC水配制）轻轻吹起洗涤，静置5min； 7）4℃，12,500rpm,离心10min； 8）弃去上清，超净台中风干，<10min；
9）用10-20uL（根据沉淀大小而定）DEPC水溶解线性化质粒； 10）
分别使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳，检测线性化质粒浓度和纯度；
（3）体外转录合成mRNA 11）
利用mMessage Machine mRNA试剂盒合成mRNA，37℃反应2-4h(因启
动子等因素，可调节转录反应时间),
反应体系为：
2×NTP/CAP 10uL 10×Reaction Buffer 2uL 线性化质粒DNA（1-3ug，常2ug）6uL Sp6/T7 Enzyme Mix 1uL RNAse Inhibitor 0.5uL Nuclease-free water to 20uL 总体积 20uL 12)37℃，气浴4h;
13)反应结束→冰上冷却，加入1 μL TURBO DNA酶，混匀，short离心， 37°C，消化 15min；
13) 加入 30 μL DEPC水和30 μL LiCl停止反应； -20°C过夜或-80℃至少2h，沉淀 mRNA；
14) 4°C， 13,000 rpm，离心15 min；弃上清，100uL 75%乙醇洗涤并风干； 15) 用适量 DEPC水（6-12 μl）溶解mRNA； 16) 取 1 μL mRNA用于电泳检测和浓度测定; 17)分装合成的mRNA，置于-80°C冻存。