发布时间 : 星期一 文章PCR和RT-PCR技术更新完毕开始阅读d4be143201f69e31433294f8
物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。
Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3'端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。
基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3'最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。
提高逆转录保温温度
为了充分利用GSP特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个GSP退火温度为55℃，那么如果使用AMV或M-MLV在低严谨性的37℃进行逆转录，GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而SuperScripⅡ和ThermoScript可以在50℃或更高进行反应，（表2）这就会消除较低温度时产生的非特异性产物（图10）。为获得最大的特异性，可以将RNA/引物混合物直接从65℃变性温度转移到逆转录保温温度，并加入预热的2×反应混合液（cDNA合成热启动）。这有助于防止低温时分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度转换。
图10. 逆转录温度对RT-PCR特异性的影响
使用ThermoScript?和设计用来同人DNA聚合酶εmRNA退火的GSP，由1μg Hela RNA合成cDNA。Thermoscript加入到预热的反应混合液中，使用Platinum Taq DNA聚合酶对1/10的cDNA进行35个循环的PCR。
减少基因组DNA污染
RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。为了避免产生于基因组DNA的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的DNaseⅠ对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mM EDTA中65℃保温10分钟以终止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的RNA水解。
为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短。另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。
增加PCR特异性 引物设计
细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：
* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 * 选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
* 设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 * 避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。 * 避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。 * 避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 * 避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。
引物退火温度
引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。表5列出确定引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
表5. 估算Tm的公式
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
递减PCR
递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。只有同同源性最高的目的模板会被扩增。这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法较为有用，如AFLP DNA指纹分析。
引物浓度
引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过Beers法则（公式1）计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式2计算。与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短，碱基组成差异很大。在Gibco/BRL定制引物的质检报告中包含了消光系数（OD/μmol）和消光系数的倒数（μmol/OD）。另外，不要使用寡聚核苷酸作为标准，在EB染色的胶上估算引物浓度，因为引物和标准的染色能力根据序列不同而差异很大。
公式1 公式2
引物纯度和稳定性
定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的（表6）。使用Invitrogen? Parallel Array Synthesis?技术，不必除盐。同其他方法相比，在Parallel Array Synthesis?技术中，通过脱盐而除去的苯甲酰基和异丁酰基很少，因此不会干扰PCR。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100％。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3'到5'合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。
表6. 用于PCR应用的引物最低建议纯度 Application PCR First-strand cDNA synthesis for RT-PCR AFLP? technology PCR using primers with 5' sequences Minimum Suggested Purity Standard Standard Standard Cartridge PAGE Standard Desalted Cartridge (restriction endonuclease sites,RNA polymerase promoter sites,etc) PCR primers > 50bases Cycle sequencing Isothermal sequencing Site-directed mutagenesis