发布时间 : 星期四 文章核酸提取常见试剂的作用原理更新完毕开始阅读c6fde31aa98271fe900ef96f
DNA裂解液的作用是破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，抑制细胞中Dnase的活性，而蛋白酶k的作用是将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来！
溶菌酶 溶壁酶 Dnase Rnase
多糖水解酶：水解多糖
饱和酚
酚是一种有机溶剂,预先要用STE 缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联：故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛,以防止酚氧化。 苯酚
非极性分子 水为极性分子
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。能有效使蛋白质变性而出去，酚形成的有机相破坏蛋白质的胶体稳定性，从而蛋白质不会分布在水相中，避免核酸污染
缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。
酚变性大，但与水相有一定程度的互溶，大约10-15%的水溶在酚相中，使核酸损失 酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
氯仿
非极性分子 水为极性分子
去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率
克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
氯仿变性不如酚好，但与水不混溶，不会带走DNA
因此混合使用最佳，经酚第一次抽提的水相有残留的酚，由于酚和氯仿互溶，可用氯仿第二次带走酚，也可在第二次抽提中混合使用，比例为1：1
苯酚/氯仿
苯酚、氯仿抽提去除蛋白质
非极性分子 水为极性分子，当蛋白水溶液与他们混合时，蛋白质分子见的水分子被挤去，使蛋白失去水合状态而变性，经离心，变性蛋白密度比对大，而与水相分离，苯酚/氯仿比重大，保留在最下层
苯酚氯仿 使蛋白质变性 量要足够，因为苯酚去除蛋白是有一定的饱和度的，超过饱和度，裂解体系中蛋白质不能被一次性去除，必须多次抽提。离心后分三层，下层有机层中有一些脂溶性的杂质，中间层白色絮状沉淀是蛋白，上清液中即含有核酸； 变性后的蛋白质从水相中析出，位于苯酚中或苯酚与水相之间。
异戊醇
抽提DNA，为混合均匀，容易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用，加入异戊醇降低分子表面张力，一般采用氯仿：异戊醇=24：1或酚：氯仿：异戊醇=25：24：1（不必先配置，临用前加入即可）
减少操作过程中产生的气泡。
减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
NaCl
提供一个高盐环境，使DNA充分溶解于液相
沉淀DNA时总会加入高浓度的盐,加盐的目的是破坏能使蛋白质保持稳定的两个因素,使蛋白和DNA分离并沉淀下来.而此时盐的阳离子会与DNA结合形成DNA-阳离子盐溶于溶液中,再用无水乙醇可以将DNA-阳离子盐沉淀下来
提取DNA时先加0.14mol/L氯化钠，因为在这种浓度的氯化钠溶液中，DNA的溶解度最低，而蛋白质的溶解度增加，这样通过过滤能将DNA分离开，以除去蛋白质。再加入95%的酒精能使DNA沉淀，因为在这个浓度下DNA溶解度最低。如果直接加酒精不先加氯化钠，DNA和蛋白质都能被酒精所沉淀，就无法将DNA和蛋白质分离开。所以必须先加氯化钠后加酒精，顺序不能颠倒。
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。这样可以是DNA沉淀出来在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。
柠檬酸钠
它可以控制反应体系的离子强度，同时还有一定的缓冲作用，保证体系PH的相对稳定状态，总之柠檬酸钠在这里的作用类似于食物中的防腐剂。
DEPC
焦碳酸二乙酯，它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。与肝素何用效果增强。在Tris中不稳定，很快会分解为二氧化碳和乙醇。 强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 0.1%浓度
Tris-HCl
缓冲体系，使pH变化不会太大
异丙醇
加入异丙醇之后立即出现絮状沉淀，我一直以为这是正确的，看了帖子才知道是蛋白质污染， 异丙醇的沉淀效果要比无水乙醇的沉淀效果要好，但是异丙醇沉淀有一个弊端就是会沉淀下来好多的盐和蛋白质这样会影响下一步的操作，一般我加异丙醇是等体积的效果还可以。
70%乙醇
70%乙醇洗涤DNA沉淀(因为在70%乙醇里DNA是不溶的,而盐离子却可溶),用无水乙醇则达不到这个目的!乙醇对于蛋白质、核酸的沉淀效应随分子量加大而增大，小分子的核酸和蛋白质碎片是可以溶于75%乙醇的。漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。
DEPC
（焦碳酸二乙酯）:常用RNA酶抑制剂，与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,强烈但不彻底的RNA酶抑制剂
甲酰胺
用高浓度甲酰胺替代苯酚从细胞裂解物的蛋白酶K消化物中分离抽提DNA，甲酰胺是 一种离子化溶剂，能分离蛋白质-DNA复合物并使蛋白变性和释放，因其不影响蛋白酶K的活性，特别适于分离高分子质量的DNA，其分离物籍火棉胶袋的透析，去除变性蛋白进而纯化DNA。
聚乙二醇PEG
有机聚合物，无毒，亲水性强，相对分子量6-20k，沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时受离子强度、溶液pH值和温度等因素的影响，采用该方法可将病毒浓缩10倍以上。为一种非离子多聚物，多离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂。基于多聚物的沉淀作用主要依赖于多聚物的浓度和被沉淀物的分子量大小，Laurent等(1967)提出PEG的沉淀机理主要是通过空间位置排斥，使液体中的微粒(包括生物大分子、病毒和细菌等)被迫集聚在—起而引起沉淀的发生。PEG最早应用于提纯免疫球蛋白(IgG)和沉淀一些细菌病毒，今年来逐渐应用于核酸和酶的分离纯化，特别是用PEG分离质粒DNA，已相当普遍。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA，可以在500ul DNA液中加入200ul 20％PEG8000(含1．2 mol／LNaCl)，冰浴20min(Li et a1．，1994)。该操作的优点在于：操作条件温和，不易引起生物大分子的变性。同时具有极高的沉淀效能，少量的PEG可以沉淀相当多的生物大分子。
乙基黄原酸钾
乙基黄原酸钾能够与多糖结合，形成可溶性复合物，使细胞壁破裂，释放出核酸。此复合物
在铵离子存在的情况下可转变为水不溶性，并可通过简单的离心除去，不需要苯酚或氯仿抽提。另外，乙基黄原酸钾能够结合金属离子，抑制DNase的活性。Tillett等(2000)利用该方法从蓝细菌、微生物、环境样品中提取到高质量的核酸，DNA可以用于酶切、克隆、PCR，RNA可以用于RT-PCR，Southern杂交等反应，并且样品中不含核酸酶，温育16 h没有发生降解。