发布时间 : 星期五 文章水稻TOS17突变体库的创建与应用更新完毕开始阅读a01032ce7e21af45b307a8f8
4.结果与分析
4.1 水稻Tos17插入突变体库的创建 4.1.2 水稻突变体库材料的选择
本研究采用中花11作为构建水稻突变体库的品种，中花11为粳稻品种，粳稻的转化体系比较高效和完善，而且中花11生长周期较长，株型整齐，结实性好，便于田间的筛选。本室利用中花11这一品种已经构建超过130,000独立的T-DNA插入突变体库，而且中花11也被其它单位选作大规模的创建突变体库的材料。
4.1.3 愈伤组织组培不同时间的愈伤分化率
Tos17是一个复制型的反转录转座子，在愈伤组培的情况下被激活，产生新的拷贝插入到基因组中，而且随着组培时间的延长拷贝数增加，但是愈伤分化成植株后Tos17转座活性消失，因此可以获得稳定遗传的突变体。但是随着愈伤组培时间的延长，植株的分化率降低而且产生过多的新拷贝不利于对后代进行正向遗传学的筛选，因此确定组培时间很重要。
将中花11愈伤组织在继代培养基中继代不同时间比较分化率。如表所示愈伤组织随着继代时间的增长分化率下降，但是愈伤组织在组培三个月的情况下，仍然可以获得76%的分化率。 表2 愈伤组培不同时间分化率
Table 2. The ratios of plant regenerated from callis culturing with different times 愈伤组培时间 Calli culturing times 1 month 2 months 3 months
4.1.4 Southern检测植株分化自不同组培时间愈伤组织的拷贝数
如图所示Tos17酶切位点和探针的位置。探针用PCR扩增野生型中花11基因组DNA得到。Southern杂交检测的样品分别是分化自愈伤组培1-3月的中花11植株的基因组DNA，以野生型中花11基因组DNA为对照。所有的样品用
愈伤数
分化植株数
Number of calli Number of regenerated plants 100 100 100
84 80 76
Xba?酶切过夜后，跑1%TAE胶电泳，转移到尼龙膜上和探针杂交。
图6. Tos17酶切位点和探针位置
Fig 6. The enzyme and probe sites in Tos17
结果如图所示，野生型中花11中含有4个拷贝，继代一个月的愈伤分化出的植株中就能检测到Tos17的新拷贝，说明Tos17的转座发生在愈伤组培的开始阶段。在愈伤组织继代培养两个月的情况下，愈伤组织分化出的植株中的几乎都含有一个Tos17的新拷贝。在继代三个月的愈伤分化出的每个植株中都可以检测到Tos17新拷贝，新拷贝数为1-3个。而且很明显随着愈伤组织培养时间的增长，分化出的植株的中的新拷贝数增加。考虑到要保证植株中都含有至少一个Tos17的新拷贝，而且较少的拷贝数有利于对突变体后代的正向遗传学筛选，因此选择三个月的时间作为大规模构建Tos17突变体库的愈伤组织继代培养时间。并且愈伤组织继代培养三个月的情况下，虽然分化率有所下降，但是仍然在保持比较高的分化率，可以达到70%以上。
图7 分化自不同愈伤组培时间的植株中的Tos17拷贝数（CK:野生型中花11；Line 2-10 组培一个月时间；Line11-20 组培两个月时间；Line 21-31组培三个
月时间）
Fig 7. The copy numeber of Tos17 in plant regenerated from different culturing times.
(CK: wide type Line1-10: the plant regenerated from calli cultured for one month; Line 11-20: the plant regenerated from calli cultured for two months; Line 21-30 the plant regenerated from calli cultured for three months.)
4.1.6 Tos17 突变体库的创建和材料编号
如图所示，将水稻中花11种子脱壳后，放于诱导培养基中，诱导愈伤组织40天后，将愈伤组织转移到继代培养基中继代培养3个月，每30天更换一次继代培养基，愈伤组织继代培养3个月后转移到分化培养基中，分化产生后代植株。共计诱导种子32000颗，产生独立愈伤25365颗，最后分化产生独立的Tos17突变体15,543株，整个突变体库的愈伤组织分化率为61.28%，分化率低的原因是愈伤组织组培过程中，存在一定数量的污染情况。
图8. Tos17突变体的创建过程 Fig 8. The creation of Tos17 mutant.
(a) The seed was cultured in N6 medium for 40 days. (b) Calli were
tansferred to new N6 medium. (c) The beginning of plant regenerated from calli. (d) Plant regenerated from calli. (e) Plant in root growth medium. 为了方便对后代大规模的突变体的同一管理，所有的种子信息都的管理都参照统一的数据库管理和编号方法进行，如种子编号“08Z11AD56”，“08”代表突变体产生的年份为2008年，“Z11”代表所用的水稻材料为中花11，“AD”表示不同的英文字母组合，代表田间不同的小区号；“56”为阿拉伯编号，代表一个小区内不同的突变单株。一个小区内的编号从1至96。 3.3
T0代Tos17突变体拷贝数Southern分析
Southern杂交所用的探针和方法同上文4.1.4中所述检测愈伤组织继代培养不同时期分化植株的拷贝数。随机选取T0代Tos17突变体200份，部分结果如图所示，200份样品中总共检测到Tos17 新拷贝280个，平均每个T0代突变体中含有1.4个新的Tos17插入拷贝，整个突变体库中含有的新的Tos17拷贝数约为21760个。
图9. T0代Tos17拷贝数检测
Fig 9. The copy number of Tos17 in T0 plant. 3.4
侧翼序列的分离与分析
4.3.1 侧翼序列的分离
本研究主要利用Adapter-PCR方法从Tos17的右边界对Tos17的侧翼序列进行分离，在分离过程中也利用到了Tail-PCR的方法，但是由于Tail-PCR的效率不稳定，而且测序效率不高，因此主要还是利用Adapter-PCR的方法。Adapter-PCR的一种非常有效的分离侧翼序列的方法，通过两步巢式PCR反应，如图分离的效率可以达到80%以上。由于我们所用的Tos17左右端特异引物据左右边界都超过100bp，因此Adapter-PCR产物跑1%凝胶电泳后，超过100bp的特异片段送上海国家基因研究中心测序，小于100bp的被认为是非特异性片段。