发布时间 : 星期日 文章各种酶活性测定方法更新完毕开始阅读9ff5d870f18583d048645926
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0.5ml酶液（对照用0.5ml 80％乙醇代替）（做三个重复） + 1ml冰乙酸 + 1.5ml显色液―――混匀，沸水浴15min，冷却后测OD520。
2.5可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》） 牛血清白蛋白：配成100μg/ml和1000μg/ml。 90％乙醇：90ml乙醇 + 10ml蒸馏水。？？？ 85％（W/V）磷酸：170ml磷酸 + 30ml蒸馏水。
考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90％乙醇中，加入85％（W/V）磷酸200ml，用蒸馏水定容到2L。常温下可保存一个月。 标准曲线的制作：
配制0～100μg/ml血清白蛋白血液 管号 1 2 3 4 5 6 100μg/ml牛血清白蛋白(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水量(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
蛋白质含量（ml） 0 0.02 0.04 0.06 0.08
0.10
配制0～1000μg/ml血清白蛋白血液 管号 7 8 9 10 11 12 100μg/ml牛血清白蛋白(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水量(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
蛋白质含量（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.1ml 酶液（做三个重复） + 5ml考马斯亮蓝G-250―――混匀，放置2min后在595nm下比色。
2.6过氧化氢酶（CAT）的测定：
0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到500ml。
1 ml 0.3%H2O2溶液 + 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液，测定240nm处OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121）
2.7 抗坏血酸（ASA）的测定：（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125） 5％ 三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g三氯乙酸，用蒸馏水定容到500ml。 10％ 三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g三氯乙酸，用蒸馏水定容到250ml。 150mmol/L NaH2PO4（pH 7.4）溶液的配制：100ml。 44％ H3PO4溶液的配制：250ml。 4％ 2,2-二联吡啶溶液的配制：250ml。
3％ FeCl3溶液的配制：100ml。 首先标制作准曲线。
粗酶液的提取：取低温保存的鲜样，称0.5g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入15m 5％三氯乙酸（TCA）溶液（最好是较冷的三氯乙酸（TCA）溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟，上清液为粗酶液，用于抗坏血酸（ASA）含量的测定。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126）
测定：0.2ml 粗酶液 + 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4（pH 7.4）溶液 + 0.2ml H2O，混匀（振荡），至少30秒后，再依次分别加入：0.4 ml 10％三氯乙酸（TCA）溶液 + 0.4 ml 44％ H3PO4溶液 + 0.4 ml 4％ 2,2-二联吡啶溶液 + 0.2ml 3％ FeCl3溶液，混合后在37℃水浴中保温60min，测定OD525处的值。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126）
2.8 谷胱甘肽的测定：
4g新鲜材料 + 2ml 0.3mol/L醋酸汞 + 2ml 30％醋酸钠后研磨匀浆，转移到离心管中，以蒸馏水冲洗残渣，并以玻璃棒搅拌，净置10min，使之充分沉淀，离心后弃去上清液，沉淀以水（每次10ml）在摇动情况下冲洗2次。向沉淀中加入10ml 1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽，以玻璃棒搅拌5min后加入1ml 20％的碘化钾溶液，混匀，离心。上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中，沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗。离心后溶液与第一次离心液合并。向得到的溶液中加入0.5ml淀粉液，用1mmol/L KIO3滴定，直至出现不消失的蓝色为止。1ml 1 mmol/L 的KIO3相当于0.307mg谷胱甘肽。（参考《现代植物生理学实验指南》，中国科学院上海植物生理研究所编）。 2.9天冬酰胺合成酶（AS）的测定：
2.10 天冬酰胺转氨酶（AspAT）的测定： 3 硝酸还原酶(NR)的测定采用离体法：（1g样）（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29） 亚硝酸钠标准溶液（1μg/ml）：称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml，再吸5ml定容到1000ml。 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液：30.0905g Na2HPO4·12H2O + 2.4965g NaH2PO4·2H2O，加蒸馏水定容到1000ml。
3mol/L HCl：125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml。 1％ 磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中。
0.2％ a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml，贮于棕色瓶中。 0.1mol/L KNO3溶液：5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液。 0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液：Na2HPO4·12H2O 8.8640g + NaH2PO4·2H2O 0.0570g，加蒸馏水定容到1L。
提取缓冲液：1.211g半胱氨酸 + 0.372g EDTA，溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液。 2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液（临用前配制）。 首先标制作准曲线:
取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂，即配成0～2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮（μg）为横坐标（x），光密度值为纵坐标（y）绘标准曲线或建立回归方程。 各试剂加入顺序 管 号 1 2
3 4 5 6 7
亚硝酸钠标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0
1％ 磺胺溶液(ml) 4 4 4 4 4 4 4
0.2%α-萘胺(ml) 4 4 4 4 4 4 4
每管含NO2- (μg) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6
2.0
1g 材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆，转移到离心管中于4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液，用于硝酸还原酶(NR)的测定。
0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3溶液 + 0.4mlNADH溶液后混匀（对照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替），在25℃水浴中保温30min。保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml 0.2％ a-萘胺溶液，显色反应15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算。