发布时间 : 星期三 文章血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定更新完毕开始阅读9a5176c086868762caaedd3383c4bb4cf7ecb720
A280nm：蛋白质溶液在280nm 处测得的吸光度； A260nm：蛋白质溶液在260nm 处测得的吸光度。
本法对微量蛋白质的测定既快又方便，它还适用于硫酸铵或其他盐类混杂的情况，这时用其他方法测定往往较困难。
为简便起见对于混合蛋白质溶液，可用A280nm 乘以0.75 来代表其中蛋白质的大致含量（mg/ml）。 2．标准曲线法 1）标准曲线的绘制
取8 支干净试管，编号，按下表加人试剂。 紫外吸收法测定蛋白质浓度 ― 标准曲线的绘制
加毕，混匀，用紫外分光光度计测A280，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。 2）样液测定
取未知浓度的蛋白液1.0ml，加蒸馏水3.0ml，测A280,对照标准曲线求得蛋白质浓度。 四、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 （一）目的
学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。 （二）原理
考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250 -蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。
在一定范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm 下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。 （三）实验器材 1．旋涡混合器
2．试管
3．吸管0.10ml、0.50ml、1.Oml、2.0ml、5.0ml 4. 722 型（或7220 型）分光光度计 5．容量瓶1000ml 6．量筒100ml 7．电子分析天平 （四）实验试剂 1. 0.9% NaCI 溶液。
2．标准蛋白液：牛血清白蛋白（0.lmg / ml ) ，准确称取牛血清白蛋白0.2g , 用0.9%NaCI 溶液溶解并稀释至2000ml 。
3．染液：考马斯亮蓝G250 ( 0.01% ) ，称取0.19 考马斯亮蓝G250 溶于50ml 95％乙醇中，再加人l00ml 浓磷酸，然后加蒸馏水定容到1OOOml。4 ．样品液：取牛血清白蛋白（0.lmg/ml）溶液，用0.9%NaCI 稀释至一定浓度。 五、操作
1．标准曲线的制备
取7 支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。
混匀，室温静置3min ，以第l 管为空白，于波长595nm 处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（ug/ml）作为横坐标作图得标准曲线。
2．样液的测定
另取一支干净试管，加人样品液1.0ml 及考马斯亮蓝染液4.0 ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm 处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。 注意：
样品蛋白质含量应在10-100ug 为宜。一些阳离子如K、Na、Mg2、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如SDS 等会严重干扰测定。
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VI 凝胶层析法分离纯化蛋白质 一、目的
了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。 二、原理
凝胶层析也称凝胶过滤、凝胶过滤层析、分子排阻层析和分子筛层析。凝胶是具有一定孔径的网状结构物质，凝胶层析是一种分子筛效应，主要用于分离分子大小不同的生物大分子以及测定其相对分子质量。相对分子质量小的物质可通过凝胶网孔进人凝胶颗粒的内部，而相对分子质量大的物质不能进人凝胶内部，被排阻在凝胶颗粒之外，随着洗脱的进行，相对分子质量小的物质由于进人凝胶内部，不断地从一个网孔穿到另一个网孔，这样“绕道”而移动，走的路程长，下来得慢（迁移速度慢），而相对分子质量大的物质因不能进人凝胶内部即随洗脱液从凝胶颗粒之间的空隙挤落下来，走的路程短，下来得快（迁移速度映），这样就可达到分离的目的。
目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶（商品名sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名Bio-GelP）、琼脂糖凝胶（商品名因生产厂家而不同，如瑞典的Sepharose ，美国的Bio-Ge1 A)，其中最常用的是sephadex。sephadex 有各种不同型号，用于分离相对分子质量大小不同的物质。 三、实验器材 1．层析柱1cm×90cm 2．恒流泵 3．紫外检测仪 4．部分收集器 5．记录仪
6．试管等普通玻璃器皿 四、实验试剂
1．待分离样品：胰岛素、牛血清白蛋白等 2．葡聚糖凝胶Sephadex G-75 3．蓝色葡聚糖2000
4．洗脱液：0.1lmol/l pH6.8 磷酸缓冲液 五、操作
1．凝胶的处理
Sephadex G-75 干粉经蒸馏水室温充分溶胀24h ，或沸水浴中3h ，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和排除凝胶内部的气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。凝胶颗粒大小要求均匀，使流速稳定。凝胶充分溶胀后用倾泌法将不易沉下的较细颗粒除去。
将溶胀后的凝胶抽干，用10 倍体积的洗脱液处理约lh ，搅拌后继续用倾泌法除去悬浮的较细颗粒。 2．装柱
将层析柱垂直装好，关闭出口，加人洗脱液约Icm 高。将处理好的凝胶用等体积洗脱液搅成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加人柱中，待底部凝胶沉积约Icm 高时，再打开出口，继续加人凝胶浆，至凝胶沉积至一定高度（约70cm ) 即可。装柱要求连续，均匀，无气泡，无“纹路”。 3．平衡
将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱人口相连，用2 一3 倍床体积的洗脱液平衡，流速为0.5ml / min 。平衡好后在凝胶表面放一片滤纸，以防加样时凝胶被冲起。 柱装好和平衡后可用蓝色葡聚糖2 000 检查层析行为，在层析柱内加lml ( 2mg / ml ）蓝色葡聚糖2 000 ，然后用洗脱液进行洗脱（流0.5ml／rnin ) ，若色带狭窄并均匀下降，说明装柱良好，然后再用2 倍床体积的洗脱液平衡。 4．加样与洗脱
将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1 司样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，用少量洗脱液洗柱内壁2 次，加洗脱液至液层4cm 左右，按上恒流泵，调好流速（0.5ml / rn in ) ，开始洗脱。上样的体积，分析用量一般为床体积的1％一2% ，制备用量一般为床体积的20％一30％。 5．收集与测定
用部分收集器收集洗脱液，每管4ml。紫外检测仪280nm 处检测，用记录仪或将检测信号输人色谱工作站系统，绘制洗脱曲线。 6．凝胶柱的处理
一般凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱（2 一3 倍床体积）即可，若凝胶有颜色或比较脏，需用0.5mol/l NaOH 一0.5mol/l NaCI 洗涤，再用蒸馏水洗。冬季一般放2 个月无长霉情况，但在夏季如不用，则要加0.02％的叠氮钠防腐。