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织内部的病毒受热之后部分或全部钝化,但寄主植物的组织很少或不会受到伤
害.Kassanis(1954).解释是感染植物体内病毒的含量,反映了病毒颗粒生成和破坏的程度.在高温下,不能生成或生成病毒很少,而破坏却日趋严重,以致病毒含量不断降低,这样持续一段时间,病毒自行消灭,从而达到脱毒的目的. 6.3.2 热处理方法
(1)温汤浸渍处理 适用于休眠器官,剪下的接穗或种植的材料,在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时,方法简便易行,但易使材料受伤.
(2)热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好,将生长的盆栽植株移人温热治疗室(箱)内,一般在35～40℃.处理时间因植物而异,短则几十分钟,长可达数月.香石竹于38℃下处理两个月,其茎尖所含病毒即可被清除.马铃薯在35℃下处理几个月才能获得无病毒苗.草莓茎尖培养结合36℃处理6周,比仅用茎尖培养可更有效地清除轻型黄斑病毒.亦可采用变温方法,如马铃薯每天40℃处理4h,可清除芽眼中马铃薯的叶片病毒,而且保持了芽眼的活力.
热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒.例如在马铃薯中,应用这项技术只能消除卷叶病毒.一般来说.对于球状病毒和类似纹状的病毒以及类菌质体所导致的病害才有效,对杆状和线状病毒的作用不大.而且对寄主植物作较长时间的高温处理有钝化植物组织中的阻抗因子,致使寄主植物抗病毒因子不活化,从而增加无效植株的发生率.因此热处理需与其他方法配合应用,90才可获得良好的效果. 6.4 茎尖培养脱毒
6.4.1茎尖培养脱毒原理
感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀,病毒的数量随植株部位及年龄而异,越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低,生长点(约0.1～1.0mm区域)则几乎不含或含病毒很少.这是因为分生区域内无维管束,病毒只能通过胞间连丝传递,赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度.在切取茎尖时越小越好,但太小则不易成活,过大又不能保证完全除去病毒.
茎尖培养脱毒,由于其脱毒效果好,后代稳定,所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径.
6.4.2培养基
一般以White,Morel和MS培养基作为基本培养基,尤其是提高钾盐和铵盐的含量会有利于茎尖的生长.在MS培养基对某些植物的茎尖培养时,其中有些离子浓度过高应予以稀释.植物激素的种类与浓度对茎尖生长和发育具有重要的作用,在双子叶植物激素大概是在第2对最年幼的叶原基中合成,所以茎尖的圆锥组织生长激素不能自给,必须提高适当浓度的生长素(0.1～0.5 mg/L)与细胞分裂素,在生长素中应避免使用易促进愈伤组织化的2,4-D,宜换用稳定性较好的NAA或IBA,细胞分裂素可用Kt或 BA.GA3对某些植物茎尖培养是有用的.有时茎尖培养添加活性炭.
在茎尖培养中,由于操作方便,一般都使用琼脂培养基.不过,在琼脂培养基能诱导外植体愈伤组织化的情况下,最好还是用液体培养基.在进行液体培养时,须制作一个滤纸桥,把桥的两臂浸入试管内的培养基中,桥面悬于培养基上,外植体放在桥面上. 6.4.3茎尖培养方法
在进行脱毒培养时,由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作,因而需要一台带有适当光源的简单解剖镜(8～40倍).除了在进行植物组织无菌培养一般工具外,还需要一套解剖刀.剥离茎尖时,应尽快接种,茎尖暴露的时间应当越短越好,以防茎尖变干.可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作,有助于防止茎尖变干.
不过和其他器官的培养一样,在进行茎尖培养时,首要是获得表面不带病原菌的外植体.因此,一般来说,茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护,只要仔细解剖,无须表面消毒
就可以得到无菌的外植体.有时消毒处理还会增加培养物的污染率,所以选取茎尖前,可把供试植株种在无菌的盆土中,放在温室中进行栽培.浇水时要直接浇在土壤中而不要浇在叶片上.另外,最好还要给植株定期喷施内吸杀菌剂,可用多菌灵0.1%和抗生素(如0.1%链霉素).对于某些田间种植的材料,可以切取插条插入Knop溶液中令其长大,由这些插条的腋芽长成的枝条,要比由田间植株上直接取来的枝条污染小得多.
为了保险起见,在切取外植体之前一般仍须对茎芽进行表面消毒.叶片包被严紧的芽,如菊花,兰花,只须在75%酒精中浸蘸一下,而叶片包被松散的芽,如香石竹,蒜和马铃薯等,则要用0.1%次氯酸钠表面消毒l0min.对于这些消毒方法,在工作中应灵活运用,如在大蒜茎尖培养时,可将小鳞茎在75%酒精中浸蘸一下,再用灯火烧掉酒精,然后解剖出无菌茎芽.
在剖取茎尖时,把茎芽置于解剖镜下,一只手用细镊子将其按住,另一只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉,解剖针要常常蘸入90%酒精,并用火焰灼烧以进行消毒.但要注意解剖针的冷却,可蘸人无菌水进行冷却.当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后,用解剖刀片将分生组织切下来,为了提高成活率,可带1～2枚幼叶,然后将其接到培养基上.接种时确保微茎尖不与其他物体接触,只用解剖针接种即可.将接种好的茎尖置于22℃左右的温度下.每天以16h2000～3000Lx的光照条件下培养.由于在低温和短日照下,茎尖有可能进入休眠;所以较高的温度和充足的日照时间必须保证.微茎尖需数月培养才能成功. 茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同,这里不再叙述. 6.4.4 影响微茎尖培养的因素 6.4.4.1 外植体大小
在最适培养条件下,外植体的大小决定茎尖的存活率,外植体越大,产生再生植株的机会也就越多,而外植体越小脱毒效果越好.除了外植体的大小之外,叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力,一般认为,叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素.在含有必要的生长调节物质的培养基中,离体顶端分生组织能在组织重建过程中迅速形成双极性两端. 6.4.4.2 培养条件
在茎尖培养中,光下培养的效果通常比暗培养效果好,如马铃薯茎尖培养时,当茎已长到1cm高时光照强度便增加到4000Lx. 6.4.4.3 外植体的生理状态
茎尖最好要由活跃生长的芽上切取,在香石竹和菊花中,培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好.但在草莓中,二者没什么差别.取芽的时间也很重要,一般选作萌动期较好.否则采用某种适当的处理,打破休眠才能进行. 6.5 其他途径脱毒
6.5.1愈伤组织培养脱毒
通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织,然后从愈伤组织再分化产生芽,长成小植株,可以得到无病毒苗.感染烟草花叶病毒的愈伤组织经机械分离后,仅有40%的单个细胞含有病毒,即愈伤组织无病毒植株.愈伤组织的某些细胞之所以不带病毒,其理由是:①病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度;②有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性.对病毒侵袭具有抗性的细胞可能与敏感的细胞共同存在于母体组织之中.但是,愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定,可能会产生变异植株,并且一些作物的愈伤组织尚不能产生再生植株.
6.5.2茎尖微体嫁接
木本植物茎尖培养难以生根成植株,将实生苗砧木在人工培养基上种植培育,再从成年无病树枝上切取0.4～1.0mm茎尖,在砧木上进行试管微体嫁接,以获得无病毒幼苗.这在桃,柑橘,苹果等果树上已获得成功,并且有的已在生产上应用.
6.5.3化学疗法脱毒
许多化学药品(包括嘌呤,嘧啶类似物,氨基酸,抗菌素等)对离体组织和原生质体具有脱毒效果.常用的药品有:8-氮鸟嘌呤,2-硫脲嘧啶,杀稻瘟抗菌素,放线菌素D,庆大霉素等.例如,将100ug2-硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY (马铃薯病毒). 6.6 病毒植物的鉴定
从上述途径培育得到的植株,必须经过严格的鉴定,证明确实无病毒存在,才是其正的无病毒苗,才可以提供给生产应用.鉴定的方法有多种. 6.6.1指示植物(indicating Plant)法
利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法,就是枯斑和空斑的测定法.这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物,又称鉴别寄主.它只能鉴定靠汁液传染的病毒.
指示植物法最早是美国的病毒学家Holmes 1929年发现的.他用感染TMV的普通烟叶的粗汁液和少许金刚砂相混合,然后在烟叶子上摩擦2～3d后叶片上出现了局部坏死斑.在一定范围内,枯斑与侵染性病毒的浓度成正比.这种方法条件简单,操作方便,故一直沿用至今,仍为一种经济而有效的鉴定方法.枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度,而只能测出病毒的相对感染力.
由于病毒的寄生范围不同,所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物.此外还要求所选择的指示植物不但一年四季都容易栽培,并且在较长的时期内还能保持对病毒的敏感性和容易接种,而且在较广的范围内具有同样的反应.指示植物一般有两种类型:一种是接种后产生系统性症状,其病毒可扩展到植物非接种部位,通常没有局部病斑;另一种是只产生局部病斑,常由坏死,褪绿或环状病斑构成.
在接种时从被鉴定植物上取1～3g幼叶,在研钵中加10ml水及少量磷酸缓冲液(pH值7.0),研碎后用两层纱布滤去渣滓,再在汁液中加入少量的500～600目金钢砂作为指示植物叶片的摩擦剂,使叶面造成小的伤口,而不破坏表面细胞.以后用棉球蘸取汁液在叶面上轻轻涂抹2～3次进行接种,后用清水冲洗叶面.接种时可用手指涂抹,用纱布或用喷枪等来接种.为确保接种质量接种工作应在防蚜虫温室中进行,保温15～25℃.接种后2～6d 可见到上述症状出现.
木本多年生果树植物及草莓等无性繁殖的草本植物,由于采用汁液接种法比较困难,所以通常采用嫁接接种的方法.以指示植物作砧木,被鉴定植物作接穗,常用劈接法. 6.6.2 抗血清(antiserum)鉴定法
植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白,因而是一种较好的抗原,给动物注射后会产生抗体,抗体存在于血清之中称抗血清.不同病毒产生的抗血清有各自的特异性.用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类.这种抗血清就是高度专一性的试剂,这种方法特异性高,测定速度快,一般几小时甚至几分钟就可以完成.所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一. 抗血清鉴定法要进行抗原的制备(包括病毒的繁殖,病叶研磨和粗汁液澄清等),抗血清的采收,分离等.血清可分装到小玻璃瓶中,贮存在-15--25℃的冰冻条件下.测定时,把稀释的抗血清与未知的病毒植物在小试管内混合,这一反应导致形成可见的沉淀.然后根据沉淀反应来鉴定病毒.
三,电子显微镜(electric microscope)检查法
由于人的眼睛难以观察小于0.1mm的微粒,而借助于普通光学显微镜也只能看到小至200um的微粒,所以只有通过电子显微镜才能分辨0.5um大小的病毒颗粒.这样采用电子显微镜既可以直接观察病毒,检查出有无病毒存在,了解病毒颗粒的大小,形状和结构,又可以鉴定病毒的种类.这是一种较为先进的方法,但需一定的设备和技术.
由于电子的穿透力很低,制品必须薄到10~100um,通常制成厚20um左右的薄片,置于铜载网
上,才能在电子显微镜下观察到.近代发展使电镜结合血清学检测病毒,称为免疫吸附电镜(ISEM).新研制的电镜铜网用碳支持膜使漂浮膜到位,用少量的稀释抗血清孵育30min,就可以把血清蛋白吸附在膜上,铜网漂浮在缓冲溶液中除去过量蛋白质,用滤纸吸干,加入一滴病毒悬浮液或感染组织的提取液,1~2h后,以前吸附在铜网上的抗体陷入同源的病毒颗粒,在电镜下即可见到病毒的粒子.这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒.
四,酶联免疫鉴定法(Enzyme linked jimmunity absorption assay ELISA)
酶联免疫鉴定法是指采用酶标记抗原或抗体的定量测定法.将抗原固定在支持物上,加入待检血清,然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体,使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合,最后用特殊分光光度计测定.此法是现在灵敏度较高和常使用的方法. 6.7无病毒植物的利用
6.7.1无病毒苗的保存繁殖
无病毒植株并不是有额外的抗病性,它们有可能很快又被重新感染.所以一旦培育得到无病毒苗,就应很好地隔离与保存.这些原原种或原种材料保管得好可以保存利用5～10年.通常无病毒苗应种植在隔虫网内,使用300目(网眼为0.4~0.5mm大小)的网纱,才可以防止蚜虫的进入.栽培用的土壤也应进行消毒,周围环境也要整洁,并及时喷施农药防治虫害,以保证植物材料在与病毒严密隔离的条件下栽培.有条件的地方可以到海岛或高岭山地种植保存,那里气候凉爽,虫害少,有利于无病毒材料的生长与繁殖.另一种更便宜的方法,是把由茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存. 6.7.2无病毒苗的利用
无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染.生产场所应隔离病毒感染途径,做好土壤消毒或防蚜等工作.在此种植区及种植规模小的地方,要较长时间才会感染.而在种植时间长,轮作及种植规模大的产地则在短期内就可以感染.一旦感染,便会影响产量和质量的保证.因此,应重新采用无病毒苗,以保证生产的质量. 6.7.3无病毒苗的效果
无病毒苗可以表现出明显的优良效果.如草莓可增产20%～50%,植株结果多,单果重增加,上等果比例提高.菊花切花品种的脱毒株,表现出株高增加,切花数增多,花朵大,切花较重等特点.
复习思考题
(1)组织培养在生产脱毒苗木上有何意义
(2)热处理为什么可以去除部分植物病毒 热处理方法分为几种,常用的是哪一种 (3)为什么用微茎尖组织培养形成的试管苗一般是无毒的 (4)分离微茎尖与分离普通茎尖有何区别
(5)如何鉴定茎尖培养而成的脱毒苗确实是无毒的 (6)怎样保存和利用无毒苗
第七章 园林植物花药和花粉培养(2学时) 教学目的与要求:
1,通过本课学习使同学们了解花药接种的最佳时期;
2,掌握花药和花粉培养的区别及花粉发育的四种途径和大致过程. 教学重点与难点: 重点:花粉培养.
难点:花粉及花药接种的最佳时期.
花药是植物花的雄性器官,包括体细胞性质的药壁和药隔组织,以及雄性性细胞的花粉粒.按染色体的倍性来看,前者为二倍体细胞,后者为单倍体细胞.因此,花药培养属器官培养,花粉