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色谱柱：μ-Bondapak C-18（300×3.9mm）；流动相：60%甲醇，用磷酸调pH3-4；流速：1.2ml/min；检测器：紫外254nm；灵敏度：0.1AUFS；纸速：0.5cm/min；柱温：室温；进样量：10μl。 四、计算
根据类黄酮标准的保留时间定性，根据标准的峰高或峰面积确定样品中黄酮的含量。
五、注意事项
类黄酮对热、氧、适中酸度相对稳定，但遇光迅速破坏，故在实验操作时应避免强光直射或在半暗室中进行。
实验二十八 绿色果蔬分离叶绿素及其含量测定
一、引言
叶绿素存在于果蔬、竹叶等绿色植物中。叶绿素在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体，当细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光或热较敏感；在酸性条件下生成绿褐色脱镁叶绿素，加热可使反应加速；在稀碱液中可水解为叶绿酸盐（鲜绿色）、叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有a、b两种，二者都易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿中。
叶绿素的含量测定方法多种，其中有：
（1） 原子吸收光谱法：测定镁含量，可以间接算出叶绿素含量。
（2） 分光光度法：测定叶绿素提取液的最大吸收波长的光密度，然后通过公式计算
获得叶绿素含量数据。此法快速、简便。其原理如下：
叶绿素a、叶绿素b对645nm和663nm波长的光有吸收高峰，且两吸收曲线相交于652nm处。因此，测定提取液在645nm、663nm、652nm波长下的光密度，并根据经验公式计算，可分别得到叶绿素含量数据。
V
叶绿素a含量=[12.7(D663)—2.69(D645)]×————(mg/g鲜重)
1000×W
V
叶绿素b含量=[22.9(D645)—4.68(D663)]×—————(mg/g鲜重)
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1000×W
V
总叶绿素a含量=[20.0(D645)+8.02(D663)]×————(mg/g鲜重)
1000×W
如果只要求测定总叶绿素含量，则只需测定一定浓度提取液在652nm波长的光密度。其总叶绿素含量按下式计算：
D652 V
总叶绿素=————×————（mg/g鲜重） 34.5 1000×W
D——表示在所指定波长下，叶绿素提取液的光密度读数； V——为叶绿素丙酮提取液的最终体积（ml）； W——为所用果蔬组织鲜重（g）。
二、实验材料、试剂与仪器
绿叶青菜，黄瓜，玻璃砂。 丙酮。 分光光度计
三、实验步骤
（一）叶绿素提取及含量测定
均匀称取青菜样品5g于研钵中，加入少许玻璃砂（约0.5-1g），充分研磨后倒入100ml容量瓶中，然后用丙酮分几次洗涤研钵并倒入容量瓶中，用丙酮定容至100ml。充分振摇后，用滤纸过滤。取滤液用分光光度计分别于645nm、663nm和652nm波长下，测定其光密度。以95%丙酮作空白对照实验。将测定记录数据列表，按照公式分别计算青菜组织中叶绿素a、b和总叶绿素含量。
（二）叶绿素在酸碱介质中稳定性实验
分别取10ml叶绿素提取液，滴加0.1M盐酸和0.1M NaOH溶液，观察提取液的颜色变化情况，并记录下颜色变化时的pH值。
四、注意事项
（1）所计算出的叶绿素含量单位为mg/g 鲜重。这一单位有时太小，使用不方便，可乘于1 000倍，变为μg/g鲜重为单位。
（2）在提取叶绿素中，最终的丙酮液浓度为95%，因所用材料为菠菜等青菜，含水量极高。5g样品可视作5g水，故研磨后定容至100ml，丙酮液浓度为95%。
（3）若以黄瓜为材料，因叶绿素只存在于黄瓜皮中，取样是用锋利剖刀在黄瓜平整部
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分轻轻地将绿色表皮削下，然后称取0.5g样品研磨，加水5ml充分研磨，然后用丙酮洗涤，定容至100ml，为95%丙酮提取液。
（4）使用分光光度计调零时，必须用95%丙酮。
五、思考题
1测定叶绿素含量实验中，使用分光光度计应注意哪些问题？ 2叶绿素在酸碱介质中稳定性如何？
3试说明日常生活中炒青菜时，若加水熬煮时间过长，或加锅盖或加醋，所炒青菜容易变黄的原因？你认为应该如何才能炒出一盘保持鲜绿可口的青菜
实验二十九 水果皮颜色和淀粉白度的测量 ——测
色色差计的使用
一、实验目的：
1.通过水果皮颜色和淀粉白度的测量，了解自动测色色差计的构造，功能和工作原理。 2.通过本实验，掌握一种先进的测色方法。
二、实验材料与仪器
柑桔（不同成熟度）三种，香蕉（不同成熟度）三种，淀粉（不同白度）三种。 TC-PⅡG全自动测色色差计。
三、实验步骤 （一）样品制备
1.在柑桔皮上用小刀划出一个直径大于25mm的圆形样品，然后用滤纸把样品上的汁吸干，以免测色时污染仪器。把三种柑桔样品标号为1#、2#、3#，留待测色用。
2.方法同（1），在香蕉皮上剪出样品，把三种样品标号为4#、5#、6#，留待测色用。 3.把三种不同白度的淀粉分别装在三个样品盒中，标号为7#、8#、9#，留待测色用。 （二）色差计的使用
1.开机：联接电源，按下POWER开关，指示灯亮，表明仪器已有电源输入，同时ZERO开关灯闪烁。
2.预热仪器通电后，要预热一小时，使光源和光电探测器稳定。预热时，必须探测器放在工作白板上（注意不能放标准白板，否则标准值改变，测色不准） 3.测定准备：在仪器预热的同时，可作以下测定准备工作；
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① 将标准白板的X10、Y10、Z10值与数码器设定值核对无误。
② 放好打印纸，注意纸的正反方向，否则打印不出数值。
4.调零：经预热一小时后，开始调零。测反射色时，将探测器部分放在黑筒上，几秒种后按ZERO开关，约1秒后，ZERO开关灯由闪烁到灯灭，此时ACC灯闪烁，表示调零结束，数据自动输入到微机系统（若测透射色，调零时，将不透光纸板或胶皮放在固定架中，其余步骤同上）。
5.调标准白板：将探测器部分放在标准白板上，按ACC开关，一会儿灯灭，而MEASU灯闪烁，此时调标准白板完成，数据自动输入微机系统。（测反射色时，数码器中X、Y、Z设定值应和标准白板给出的X10、Y10、Z10一致；测透射色时，数码器中X、Y、Z设定如下：X=94.83，Y=100.00 , Z=107.381。） （三）样品的测色实验
1.将标准白板放在探测器部件下，几秒种后，按MEASU开关，灯固定发光，几秒后，打印机开始工作，并打出STANDARD（标准）标号及标准白板的颜色参量值，打印机工作结束后灯灭。
2.取下标准白板，将待测样品1#放好，几秒后，按MEASU开关，此时指示灯亮，一会儿打印机就打出编号No.001的第一个待测样品的各个参量值，2#、3#重复该步骤即可。
3. 4#、5#、6#重复步骤（2）即可得出No.004，No.005，No.006的各个参量值。 4.测定粉白度值时，只要把样品盒对准探测器的孔，重复步骤（2），即可打出No.007-009的各个参量值。 5.关机
当一批样品测色结束后，关上POWER开关，指示灯灭，切断电源，收好标准白板、工作白板、黑筒等，待仪器冷却到室温，盖上黑布罩。
四、注意事项
1.预热量，必须把探测器放在工作白板上，而不能放标准白板，否则必将使标准值改变，提高测量误差。
2.放打印纸时，要注意正、反方向。
3.每次测量时，必须严格按照操作步骤，依序操作，否则，不但测量不准，而且容易损坏仪器。
4.当测粉末样品时（如淀粉），必须把样品装在样品盒中填满，并且表面要刮平，否则，因表面凹凸不平，将使测量值不准。
5.当样品量多时，为了使测量值准确，使用半小时后，要求重新调零，调标准白板。（先按RESET复位开关，再重复色差计使用步骤中的（4）、（5），唯一不同的是，按下ACC后，MEASU不再闪烁，此时调白已完成了，可继续进行测量工作。）
6.工作时千万不能关掉POWER开关或输入电源，否则仪器需重新预热一小时，不预热，则测色不准。
7.由于TC-PⅡG全自动测色色差计是精密、贵重的仪器，使用时，要十分注意环境的清洁，不要让仪器或部件粘上污物。
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