发布时间 : 星期三 文章生物化学与分子生物学实验指导书-方成更新完毕开始阅读77c886665f0e7cd18525364e
（有时絮状物出现较慢，可放置十几分钟）。 【注意事项】 【思 考 题】
1.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?
2.为什么用酵母作为实验原料？如何使RNA从酵母中释放出来？RNA的等电点是多少？ 3 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？
4.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂分离沉淀核酸? 【课外阅读】
RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等组分，加入硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
（1）强酸使核酸分子的有机磷消化为无机磷，使之与钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀）PO43- + 3NH4+ + 12MoO42- + 24H+ ===(NH4)3PO4.12MoO3.6H2O + 6H2O；
当有还原剂（如维生素C）存在时，Mo6+被还原成Mo4+，再与试剂中的其它MoO42-结合成Mo（MoO4）2，呈蓝色，称钼蓝。所以试管C中会出现蓝色。
（2）RNA与硫酸共热，生成的核糖进而脱水转化为糠醛，三氯化铁作为催化剂，可与地衣酚反应，生成绿色化合物，所以出现绿色。（OR苔黑酚）
（3）嘌呤碱可与硝酸银反应产生白色的嘌呤银化合物沉淀。所以出现浑浊现象。 （4）不检测嘧啶碱，是因为与嘌呤碱相比，它难以被水解下来，同时它难检测且现象不明显。
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实验八：植物组织DNA粗提与鉴定（综合性；4学时）
【实验目的】
1 ．掌握 DNA 分离纯化的原理和方法。 2 ．掌握 DNA 鉴定技术。 【实验原理】
洗涤剂等去污剂可以溶解细胞的细胞壁，破坏细胞膜，同时也能使蛋白质变性。当细胞壁破坏后，细胞释放出核酸与蛋白质形成的复合物——核糖核蛋白(RNP)和脱氧核糖核蛋白(DNP)，这两种复合物在不同电解质溶液中的溶解度有较大差异。当NaCl浓度达到0.14mol/L时，DNP溶解度约为纯水中溶解度的1%，但RNP则不一样，在0.14mol/L NaCl溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此在制备DNA时，利用0.14mol／L稀盐溶液使DNP与RNP分开。
去除蛋白质后的核酸盐溶液，再利用其不溶于有机溶剂的性质，但细胞中的其他物质则可以溶于有机溶剂，应用适当浓度的有机溶剂 (如乙醇)使DNA呈絮状沉淀析出（本实验加入酒精后使食盐浓度接近0.14mol/L）。在溶液中，DNA链略带负电荷，而盐离子可被吸引到DNA的负电荷上，中和这些负电荷，因此就能够使DNA片段聚合在一起，形成絮状粘稠物质。利用这一原理，就可以用酒精萃取DNA。
DNA与二苯胺作用生成蓝色沉淀用来鉴定 DNA。 【实验条件】
洋葱或其他植物、洗洁精、NaCl、搅拌机或研钵、纱布、漏斗、烧杯、玻璃棒 、量筒(10mL一支)、滴管、试管( 20mL两支)、天平。95%酒精、蒸馏水、
2mol/LNaCl溶液：
二苯胺显色剂：称取1g重结晶二苯胺溶于100ml冰乙酸中，再加入浓硫酸2.75ml（或10ml 60%过氯酸），混匀置棕色瓶中，贮于冰箱。临用前加入1.6%乙醛溶液。所配试剂应为无色。[1 g重结晶的二苯胺溶于100ml冰乙酸（A.R.）中，再加10ml过氯酸，临用前加入1.0ml 16%的乙醛，试剂应为无色。] 【操作步骤】
1．称取100g洋葱，将洋葱切碎,放进搅拌机或研钵中，加入10mL洗洁精和1g食盐，充分搅拌或研磨。
2．将捣碎的洋葱糊用漏斗和纱布过滤到小烧杯中，得到滤液，置于冰箱中冷却几分钟。 3．取上述澄清的洋葱液10mL，沿烧杯壁缓缓倒入等量的95%酒精（冷却过的酒精效果较好），不要震动或搅拌。此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。
4. 进一步纯化：将析出的DNA再溶解于2mol/L的氯化钠溶液中。倒入等量的95%的酒精，使DNA再次析出，用玻棒搅拌，使DNA再次缠绕于玻棒末端。
5．鉴定：取两支试管，编为1、2号，各加入的0.015/L氯化钠溶液2mL，向1号试管中加入一些白色纤维状物，振荡使其溶解，然后向两支试管中各加入2mL二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟。 【注意事项】
1、洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰；或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器（榨汁机）。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。看不到白色纤维状粘稠物的DNA。
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2、DNA析出的过程中，切忌震动和搅拌（不震动易于分层，我们就能很容易观察到上清液中的丝状物；搅拌会使非常柔软的DNA断裂成小段，不易取出）。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙签，DNA提取物就缠绕在牙签上了。 【思 考 题】
1、 不同浓度NaCl溶液（2mol/L，0.14mol/L，0.015mol/L）的用途？ 2、 DNA,RNA相分离的原理？ 【课外阅读】
纯化DNA的方案：方案一：30mL含DNA的滤液＋2mol/L NaCl→同方向搅拌，DNA溶解→加入蒸馏水→DNA析出→过滤得到过滤物→放到2mol/LNaCl溶液中溶解→DNA-NaCl溶解液；方案二：30mL滤液＋嫩肉粉（木瓜蛋白酶）→静置10～15分钟→DNA滤液；方案三：30mL滤液→60～75℃恒温保温10~15分钟→过滤获得DNA滤液。
本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法。如果在没有二苯胺的情况下也可以用以下几种方法。⑴配制染色剂。用蒸馏水配制0.05%的溴化乙锭(EB)溶液。⑵将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。⑶将蜡纸放在紫外灯(260nm)下照射(暗室中)，可见橙红色的荧光(DNA的紫外吸收高峰在260nm处)。
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实验九：肝组织中核酸的提取与鉴定（综合性；4学时）
【实验目的】
1．掌握从动物组织中提取核酸的基本原理与方法。 2．了解两类核酸的组成上的主要差异和鉴定方法。 【实验原理】
细胞内的核酸多以核蛋白的形式存在，其中脱氧核糖核蛋白主要存在于细胞核中，核糖核蛋白主要存在于细胞质中。根据脱氧核糖核蛋白（DNP）与核糖核蛋白（RNP）在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离。在0.14mol/L Nacl溶液中，RNP的溶解度大，而DNP的溶解度较小；相反，在1mol/L NaCl溶液中，RNP的溶解度较小，而DNP的溶解度却很大。先用不同浓度的盐溶液将DNP与RNP分离，分离过程中加入少量柠檬酸钠，可抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解作用。然后用蛋白质变性剂使核蛋白变性解离，沉淀除去蛋白质，释放游离出核酸，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，最后根据两类核酸的组分不同主要是戊糖的不同进行DNA、RNA的鉴定。
DNA分子在酸性溶液中加热水解后，其脱氧核搪部分可被浓酸缩水成ω-羟基-γ-酮基戊醛等化合物，再进一步与二苯胺作用，可产生蓝色化合物，在595nm处有最大吸收峰，从而可进行定量侧定。待测样品中的DNA浓度在20-200ug/L之间时，其吸光度与浓度成比。反应式如下:
RNA分子中的核糖在浓酸中加热，脱水转变成糖醛，后者在氧化铁存在下，与地衣酚试剂(3，5-二羟基甲苯)反应，缩合成绿色化合物，在670nm处有最大吸收峰，从而可进行定量测定。待测样品中的RNA浓度在20-200ug/L之间时，其吸光度与浓度成正比。反应式如下:
【实验条件】
（一）器材:手术剪刀；表平皿；天平；玻璃匀浆器（或电动玻璃匀浆机）；低速冷冻离心机；烧杯；量筒；试管及试管架；玻棒；吸量管2ml，5ml；恒温水箱；滴管。 （二）试剂:
1．0.14mol/L NaCl溶液（内含0.01mol/L柠檬酸） 2．1mol/L NaCl溶液
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