发布时间 : 星期三 文章生物化学与分子生物学实验指导书-方成更新完毕开始阅读77c886665f0e7cd18525364e
实验六：马铃薯多酚氧化酶制备及性质实验（综合性；4学时）
【实验目的】
1． 学习从组织细胞中制备酶的方法。
2． 掌握多酚氧化酶的作用及各种因素对其作用的影响。 【实验原理】
多酚氧化酶是一种含铜的酶，其最适pH值为6～7。由多酚氧化酶催化的反应，如以邻苯二酚为底物，可以被氧化形成邻苯二醌。由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液的颜色的变化鉴定，这个反应在自然界中是常见的，如去皮的马铃薯和水果变成褐色就是由于该酶作用的结果。
多酚氧化酶的最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）。间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，它们也可以被氧化为各种有色物质。
酶是生物催化剂，其催化活性易受各种因素的影响，如温度、pH、底物种类、底物浓度、酶浓度以及抑制剂和蛋白质变性剂等都会改变其生物催化活性。 【实验条件】
1．马铃薯： 50g/组。
2．0.1mol/L的NaF溶液: 将4.2g氟化钠溶于1000mL水中。【41.99】
3．0.01mol/L的邻苯二酚溶液:将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中,用稀NaOH调节溶液的pH值为6.0,防止其自身的氧化作用。当溶液变成褐色时，应重新配制。新配制的溶液应贮存于棕色瓶中。【110.11】
4．pH6.8的磷酸盐缓冲液：1+1（ 0.2M Na2HPO4+0.2M NaH2PO4） 5. 5%三氯乙酸溶液 m/v 6. 硫脲， 固体
7. 0.01mol/L的间苯二酚溶液:将0.11g间苯二酚溶解于100mL水中。 8．0.01mol/L的对苯二酚溶液:将0.11g对苯二酚溶解于100mL水中。 9．硫酸铵， 固体
10．0.8％HCl：19.2mL浓HCl(42%)加水稀释到1000mL。 11．0.2%和0.3%（V/V）的乳酸溶液。 12. 0.5%的碳酸钠溶液 13．0.01％的碳酸钠溶液
14、器材：匀浆机、小刀，纱布，漏斗，其它玻璃器皿（离心管2X，50ml量杯1X，试管3X）、离心机、冰箱、恒温水浴锅 【操作步骤】
1．多酚氧化酶的制备
每三个小组一起，称取150g马铃薯（新马铃薯可以不去皮），切块后放入匀浆机，加入150mLNaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。
各组分别量取50mL滤液置离心管中，于3500转/min离心5～10min，取上清液，加入固体硫酸铵16g，溶解，于4℃放置30min，于3500转/min离心15min，倒掉上清液，沉淀用15mL pH6.8的磷酸盐缓冲液溶解，即为粗酶液，含有马铃薯多酚氧化酶。 2．多酚氧化酶的催化作用
按表1加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表1 多酚氧化酶的催化作用 试管号 酶液 邻苯二酚 水 混匀后37℃保温5～10min，观察颜色变化 1 2 15滴 15滴 15滴 － － 15滴 3 － 15滴 15滴 3． 多酚氧化酶的化学性质 按表2加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。
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试管号 1 2 酶液 15滴 15滴 表2 多酚氧化酶的化学性质 5％三氯乙酸 硫脲 振荡混匀后分别加入邻苯二酚15滴，于37℃保温10min，观察颜色变化 － 15滴 － － 3 15滴 － 少许 4．底物专一性 按表3加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。
表3 多酚氧化酶的底物专一性 试管号 酶液 邻苯二酚 间苯二酚 对苯二酚 混匀后37℃保温5～10min，观察颜色变化 1 2 15滴 15滴 15滴 － － 15滴 － － 3 15滴 － － 15滴 5．底物浓度的影响 按表4加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表4 底物浓度的影响 试管号 酶液 邻苯二酚 水 混匀后37℃保温1min，观察颜色变化 1 2 5滴 5滴 1滴 10滴 39滴 30滴 3 5滴 40滴 － 6．酶浓度的影响 按表5加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表5 酶浓度的影响 试管号 酶液 邻苯二酚 水 混匀后37℃保温2min，观察颜色变化 1 15滴 15滴 － 2 1滴 15滴 14滴 7.氢离子浓度的影响 按表6加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 管号 1 2 3 0.8% HCl 0.3% 乳酸 0.2% 乳酸 0.01%碳酸钠 0.5%碳酸钠 邻苯二酚 酶液 混合后pH值 40滴 - - - - 7滴 7滴 1 - 40滴 - - - 7滴 7滴 3 - - 40滴 - - 7滴 7滴 5 4 - - - 40滴 - 7滴 7滴 7 5 - - - - 40滴 7滴 7滴 9 37℃保温 5min，观察颜色变化,确定最适pH值 【注意事项】 【注】TCA与蛋白质之间主要有以下几个方面的作用:①在酸性条件下与蛋白质形成不
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溶性盐.②作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀.③随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显；
在电泳时使用TCA对蛋白质样品的浓缩或除盐时，对于分子质量大的蛋白质，要慎重选择TCA.对小分子量蛋白质的浓缩，采用TCA时也有两点需要注意:一是用TCA沉淀后，尽量用丙酮彻底抽提TCA;二是样品处理后要尽快进行电泳分析，以免发生聚集及断裂，造成结果分析的不准确。 【思 考 题】
1．在酶制备过程中加入硫酸铵的目的是什么？
2．在多酚氧化酶性质实验中三氯乙酸和硫脲有什么作用？ 3．该多酚氧化酶的最适pH值是多少？为什么？ 4．通过实验可知哪些因素会影响酶的催化活力？ 【课外阅读】
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实验七：干酵母核糖核酸的提取及鉴定（综合性；4学时）
【实验目的】
1、掌握酵母RNA提取的方法。
2、掌握鉴定核酸组分的方法和操作。 【实验原理】
由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。
工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这2种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法是用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA（本实验）或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
RNA分子中的核糖在浓酸中加热，脱水转变成糖醛，后者在氧化铁存在下，与地衣酚试剂(3，5-二羟基甲苯)反应，缩合成绿色化合物，在670nm处有最大吸收峰，从而可进行定量测定。待测样品中的RNA浓度在20-200ug/L之间时，其吸光度与浓度成正比。反应式如下:
【实验条件】
1．器材：①干酵母粉（市售）。②鲜酵母（市售）。③pH试纸（pH1—10）。④台天平（100g）。⑤烧杯100ml（×1）。⑥量筒50ml（×1）、10ml（×1）。⑦抽滤瓶500ml（×1）、布氏漏斗φ10cm（×1）。⑧吸管0.5ml（×1）、1ml（×2）、2ml（×2）、5ml（×1）。⑨离心机5000r·min-1。2．试剂：①0.2%氢氧化钠溶液：2gNaOH溶于蒸馏水并稀释至1000ml。②乙酸（A·R）。③95%乙醇。④无水乙醚（C·P）。⑤氨水（C·P）。⑥10%硫酸溶液：浓硫酸（比重1.84）10ml，缓缓 倾于水中，稀释至100ml。⑦5%硝酸银溶液：5gAgNO3溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。⑧苔黑酚—三氯化铁试剂：将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O。临用时配制。 【操作步骤】
1．RNA的提取：置4g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（石蕊试纸），离心10-15分钟
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（4000r·min）。取上清液，加入95%乙醇30ml，边加边搅。加毕，静置，待完全沉淀，过滤。滤渣先用95%乙醇洗2次（每次约10ml），继用无水乙醚洗2次（每次10ml），洗涤时可用细玻棒小心搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可作鉴定。
2．鉴定：取上述RNA约0.5g，加10%硫酸液5ml，加热至沸1-2分钟，将RNA水解。 （1）取水解液0.5ml，加苔黑酚-FeCl3试剂1ml，加热至沸1分钟，观察颜色变化。 （2）水解液2ml，加氨水2ml及5%硝酸银溶液1ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物
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