发布时间 : 星期二 文章分子生物学实验课件更新完毕开始阅读77a4c01214791711cc7917bf
11、移液枪、灭菌枪头、离心管 四、实验步骤
(1) 将CTAB Buffer放于65℃水浴中预热；
(2) 取0.2 g烟草叶片放入1.5ml离心管中，用镊子夹住离心管浸入液氮中充分速冻
(3) 从液氮中取出用研棒迅速研磨成粉末；
(4) 立即加入700ul预热的CTAB Buffer；同时加入巯基乙醇至终浓度10ul，在65℃水浴中轻轻摇动10-15 min；
(5) 加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1，v/v），室温下颠倒离心管数次保证样品与溶液充分作用，15-20℃ 12000 rpm离心10 min;
(6) 将上清转移至另一个15 ml离心管中；
(7) 加入至少2/3体积的异丙醇，同时加入NaAc至终浓度为0.1 M（每10 ml上清中加入7 ml异丙醇，580 ul 3 M NaAc）,轻轻旋转混匀，-20℃沉淀1-2 hr；
(8) 12000 rpm离心10 min，除去残余液体；
(9) 用预冷的70%乙醇洗涤2次，低速离心（6000 rpm，10 min）除去残余液体；
(10) 用预冷的无水乙醇浸泡DNA沉淀5 min，12000 rpm离心5-10 min，除去上清， 37℃干燥。 (11) 20ul ddH2O或TE buffer溶解，加入0.5ulRNAase置于37℃数小时。 (12) 4℃短时间保存，或-20℃长时间保存。\\
实验九 紫外分光光度法测定核酸浓度
一、实验目的：
1、了解紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理2、熟悉分光光度计的操作；3、计算DNA含量，学习核酸浓度的定量技术。
二、实验原理
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，在240~290nm的紫外波段有强烈的吸收峰，DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值，其吸光率（absorbance）以A260表示。A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特性，所以可以用紫外分光光度计通过测定核酸溶液对光的吸收确定核酸的浓度和纯度。但不能区分DNA与RNA的含量。
纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。样品中如果混杂有蛋白质或苯酚，A260/A280比值会明显降低。通常在A260nm波长下，以1OD值相当于50μg／mL双螺旋DNA，或40μg／mL单链DNA（或RNA），或20μg／mL寡核苷酸加以计算。此法操作简便，迅速。但若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故为了测定准确应设法预先除去。 三、试剂与仪器设备：
DNA样品；灭菌双蒸水（ddH2O）
紫外分光光度计；狭缝石英比色杯；微量移液器、加样枪头
四、实验步骤
1、接通紫外分光光度计电源，使仪器处于紫外测定状态下预热20min； 2、调波长至所需，吸取1ml ddH2O至石英杯中调节分光光度计零点；
3、倒掉ddH2O，在石英杯中加入已稀释好的DNA样品溶液，进行相应波长下的光吸收值的测定； 4、测定完毕，将石英杯中的样品溶液回收回指定的容器中；
5、用洗瓶洗涤石英杯，再重复2-4步骤进行第二个波长下的光吸收值的测定；
6、通过测定的260nm和280nm的OD值，计算A260/A280比率。比率>1.6说明DNA纯度较高； 7、计算DNA浓度
五、实验结果分析
所测样品纯度，可能含有的杂质，样品DNA大致的浓度。