发布时间 : 星期一 文章分子生物学实验课件更新完毕开始阅读77a4c01214791711cc7917bf
加样点样孔加入6ul DNA Marker。注意每加完一个样品要更换tip枪头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在5V/cm。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2～1cm时,停止电泳。
6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。
7、观察：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。
[注意] EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
五、实验结果分析
质粒DNA电泳条带的形态。根据DNA marker分析质粒DNA溶液大致的浓度。
六、思考题
1、电泳时所加电压值如何确定?
答：可根据DNA大小来确定，越大的电压可低点，避免拖尾现象；越小的电压可适当大一点缩短电泳时间，避免时间过长DNA扩散导致条带模糊。
2、就你的理解，DNA marker的用途是什么? 答：分析DNA大小和浓度的依据。 3、电泳中用到两种buffer，各自的作用。 答：
上样缓冲液主要作用：
（1）螯合Mg 2＋，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/l的EDTA。
（2）增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。而在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。
（3）指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。
电泳缓冲液的作用：
一是维持合适的pH；二是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移。 此外，电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。
4、如果质粒DNA电泳条带只有一条，说明提取的质粒质量高还是低，为什么？ 答：质量高。这说明产生只有超螺旋的正常质粒闭合环双链DNA。
实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备
一、 实验目的
掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法
二、 实验原理 1、 感受态细胞的概念
重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效
表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、 转化的概念及原理
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
然后在选择性培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在加入抗生素的培养基上形成菌落。
三、 实验材料、设备及试剂 1、实验材料
前次实验中所复壮的大肠杆菌单菌落液体培养物 2、实验设备及器具
低速冷冻离心机、超净工作台、50 ml 离心管、10 ml刻度移液管、玻璃棒（三种器具均已经过灭菌处理）。 3、试剂及配置
0.1 M氯化钙溶液（配制：称取1.1g无水氯化钙，溶于90ml双蒸水中，定容至100 ml, 转移至试剂瓶中，121 ℃灭菌20 min，保存。
四、 实验步骤
教师完成： 1.挑取实验一中平皿培养基上生长良好、外观呈圆形的单菌落，接种于实验一配好的LB液体培养基（试管装）中，37 ℃ 200rpm振荡培养14 h 。
2.按1：50-1：100的比例进行接种，例取1.5 ml 上述培养物转接在25 ml LB液体培养基中，37 ℃ 200rpm振荡培养2-3 h （菌液的OD600约为0.4－0.5）。
学生操作： 3.每小组（按实验一确定的4人组）领取一支离心管（已灭菌，不要随便打开），贴上自己的
标签（铅笔写学号），按老师安排两个小组同步在超净工作台上工作，每个小组用10 ml的移液管（已灭菌）吸取10 ml菌液放入自己的离心管中，两个小组将离心管与盖子一起置天平上进行平衡，平衡后盖上盖子置于盛有冰块的盆中冰浴10分钟（时间可超过十分钟）。待满8管后送至离心机所在的实验室中，4000 rpm ，4 ℃,离心10 min 。
4.两小组同步在超净工作台上倾去上清液，用5 ml的移液管（已灭菌）量取5 ml预冷的氯化钙溶液加入离心管中，用手轻弹管壁将沉淀混匀,两小组间用氯化钙平衡，冰浴25 min（可延长） ,待有8管后4000rpm，4 ℃,离心10 min。
5.在超净工作台上倾去上清液，用取液枪吸取1ml冰浴预冷的氯化钙溶液加入离心管中，轻弹管壁使细菌悬浮，制成感受态的细胞悬浮液，用取液枪转移至预冷的1.5ml eppendolf管中，按顺序摆放在离心管盒中，置－70 ℃ 保存。
注意：实验从第三步开始，整个实验过程都必须无菌操作！ 五、思考题
1、用试剂瓶盛装的氯化钙在灭菌时应怎样操作？
答：可以高温高压灭菌，也可以过滤灭菌。高温高压灭菌注意盖子不要盖得太紧。 2、步骤3和4中，对离心机应当做什么样的预处理？
答：由于整个实验都应在低温下进行，因此需要对离心机进行4 ℃的预冷。 3、实验为什么必须全程在无菌条件下操作？
答：防止杂菌和杂DNA的污染。否则会影响转化效率或杂DNA的转入。
实验五 质粒DNA的转化与转化体筛选
一、实验目的：
了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义，学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 二、实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并在宿主中实现其携带基因的转录、表达。本实验使用的pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp )，理论上只有转入了pUC19质粒的大肠杆菌才能在含Amp的培养基上生长。但抗性筛选只是初步的筛选，可能仍有部分未转进质粒的细菌能在抗性培养基上生存（假阳性），因此尚需提取质粒酶切、电泳作进一步的鉴定。 三、试剂与仪器设备：
1．LB培养基 液体培养基：
蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction) 0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0
固体培养基：100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉
含氨苄青霉素（Amp）50mg/l的固体LB培养基 LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手时加入Amp铺培养皿。
2．0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。 3．pUC19质粒 配制成约50ng/μl。 4．感受态DH5α大肠杆菌 5．恒温水浴箱 6．超净工作台 7．恒温摇床 8．生化培养箱 9．无菌离心管 10．无菌tips 11．玻璃涂布器 12．75%乙醇 13．标记笔 四、实验步骤 教师操作：
1、从-70℃冰箱中取出感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上
学生操作（四人一组）：
2、每组从冰上取2管感受态细胞悬液（每管200μl），其中一管加入50ng/μl的pUC19质粒DNA溶液1ul，贴上各自组的标签，另一个加入1 ul无菌水后，也贴上标签，两个离心管同时在冰上放置30分钟。
3、将两个离心管同时转入42℃水浴中热激90秒后，迅速置于冰上1-2分钟。在超净工作台上分别向两管中加入800 ul LB液体培养基(不含Amp)，37℃恒温摇床缓慢振荡培养45分钟。
4、以5000rpm离心浓缩菌液，在超净工作台上分别取上述两个离心管中的菌液100μl ，各自涂布于一个含Amp的筛选平板上，用标记笔分别标记为转化组、对照组，待菌液干后，倒置于37℃恒温培养箱中培养16-24小时（第二天下午3：00后观察实验结果）。
转化实验本应设置两个对照：
对照组1 用来判断不加入质粒的大肠杆菌在抗性培养基上生长的状况，排除假阳性 对照组2 用来判断制备成感受态后的大肠杆菌在普通培养基上的生长状况
五、计算转化率
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数（CFU）可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×涂板前离心管中菌液体积／涂板时所用菌液体积 转化频率 ＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg) 转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数