发布时间 : 星期六 文章园艺生物技术复习题及答案更新完毕开始阅读72d083e4524de518964b7d14
9、目前鉴定脱毒苗的方法有哪些？各有何特点？ （1）直接检测法：直接观察脱毒植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒引起的可见症状。 （2）指示植物法：将一些对病毒反应敏感、症状特征显著的植物作为指示植物（又称鉴别寄主），利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法。这种方法条件简单，操作方便，为一种经济而有效的鉴定方法 （3）抗血清鉴定法：用已知抗血清鉴定未知病毒的种类。这种方法特异性高，测定速度快。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。 （4）分子生物学鉴定法： ①双链RNA法(dsRNA)：受RNA病毒侵染的植物，有病毒的双链RNA(dsRNA)存在；健康植株则无。 ②互补DNA(cDNA)检测法：用人工合成的能与病毒碱基互补DNA，作为探针，与从待测植物中提取RNA进行DNA-RNA分子杂交。有荧光标记的证明有病毒存在 （5）电镜检查法：可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可以鉴定病毒的种类。优点是方法先进、灵敏度高、能在植物粗提取液中定量测定病毒。但需一定的设备和技术。 基因工程部分
基本概念
1、基因：能够表达和产生蛋白质和RNA的DNA序列，是决定遗传性状的功能单位。 2、基因组：细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。
3、基因工程：有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。 4、转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。
5、感染：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。
6、转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。
7、转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。
8、DNA变性：在物理或化学因素的作用下，导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则
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不受影响。
9、 DNA复性：当促使变性的因素解除后，两条DNA链又可以通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构。 10、分子克隆：在体外对DNA分子按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。
11、RFLP：即限制性片段长度多态性，个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。若因此而改变了限制性内切酶的酶切位点则可导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化，称为RFLP。
12、PCR技术： 聚合酶链反应，它是一种模拟天然DNA复制过程，在有DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、RNA引物和四种dNTP的情况下，通过高温变性（90℃－95℃，1－2min）,低温退火（25℃－37℃，1－2min）,中温延伸（60℃－75℃，90 sec-5min）,这样反复循环的过程中，在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。 13、RT-PCR：反转录 PCR ，先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。 14、同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。 15、克隆载体：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。
16、表达载体：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成肽链而特意设计的载体称为表达载体。 17、质粒：细菌细胞质中独立于细菌染色体之外能自主地进行复制的遗传单位。
18、染色体组性：染色体组型是指生物体细胞所有可测定的染色体特征总称。包括染色体总数、染色体组数、每条染色体大小和形态、着丝点的位置等。
19、带型：用染色体分带技术体所产生的明显的染色带（暗带）和未染色的明带相间的带纹，使染色体呈现鲜明的个体性的技术。
20、RAPD：随机引物扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）是在PCR技术的基础上，以一系列不同的，随机排列的寡聚核苷酸单链为引物，与变性后的模板链退火，在DNA聚合酶的作用下，合成一段新的互补DNA链。
21、卫星DNA：真核生物基因组酶切、离心后，在主带附近会出现（AT）含量很高的简单高度重复序列。 22、AFLP：扩增片段长度多态性Amplified fragment length polymorphism（AFLP）是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术上发展起来的DNA 多态性检测技术。
23、基因芯片技术：是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。
24、 Southern印迹杂交：是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段的技术。 25、Northern印迹杂交：指将RNA分子变性及电泳分离后、从电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方
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法．又称为Northern RNA印迹杂交等。
26、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)：是识别DNA的特异序列(4~8bp), 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 基本技术
1、介绍限制性内切酶的切割方式
限制性内切酶的切割方式有三种类型分别是（在对称轴5' 侧切割产生5' 粘端 ）（在对称轴3' 侧切割产生3' 粘、端（在对称轴处切割产生平段）。 2、列举基因工程常用工具类
工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ ① 合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3′末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等 反转录酶 ① 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 3、简介目的基因获取方法
⑴. 化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 ⑵.基因组DNA文库(genomic DNA library) ⑶. cDNA文库(cDNA library)
⑷. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
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4、探针的标记法？
答：⑴、缺口平移法：此法是利用适当浓度的DNase Ⅰ在DNA双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5末端和3末端，3末端就可以作为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的催化下，以互补的DNA单链为摸板，依次将dNTP连接到切口的3末端的羟基上，合成新的DNA单链；同时DNA聚合酶Ⅰ的5→3的核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。
⑵、随机引物法：随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些引物与变性的DNA单链结合后，以4种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的切带有标记物的DNA探针。
⑶、PCR标记法：在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP， 这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。
⑷、末端标记法：只是将DNA片段的一端进行标记。 5、分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？ 答：（1）、常用的工具酶
①、 限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。 ②、 DNA连接酶：将两段DNA分子拼接起来的酶。 ③、 DNA聚合酶：催化单核苷酸链延伸。
④、 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。
⑤、 末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端。 ⑥、 碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基团。 ⑦、 依赖DNA的RNA聚合酶：识别特异性启动子，RNA转录。 （2）、良好载体的条件
①、必须有自身的复制子；②、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA插入；③、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子；④、载体分子必须有足够的容量；⑤、可通过特定的方法导入细胞；⑥、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调控元件。
6、举出基因文库构建中对重组子筛选的3种方法并简述过程。
抗生素抗性筛选、抗性的插入失活、兰-白斑筛选 或PCR筛选、差式筛选、DNA探针
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