发布时间 : 星期三 文章酵母双杂交操作步骤(中文翻译)更新完毕开始阅读626922743868011ca300a6c30c2259010202f3ce
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念：
1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？
各种SD培养基：
1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml) （？
“四缺”）
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖 20g (即2%)
2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%)
3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%)
4) SD/-leu (1000 ml)
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%)
5) SD/-trp (1000 ml)
酵母氮源（YNB）：6.7g ;
-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%)
注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。
实际配制的方法是：
1. 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃
以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（过滤即可使用） 2. 酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（大约加10M NaOH
200ul即可），之后补水至950 ml。
3. 高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
YPD培养基(1000 ml)
20 g/L 蛋白胨 10 g/L 酵母提取物
20 g/L 琼脂（只有制作平板才用） 20 g/L 葡萄糖 (即2%)
1x YPDA培养基(1000 ml)
20 g/L 蛋白胨 10 g/L 酵母提取物
0.03 g/L 腺嘌呤 （即终浓度为0.003％）腺嘌呤可以耐受高温 20 g/L 葡萄糖 (即2%)
实际配制的方法是：
1. 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃
以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用） 2. 配制0.2%的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将15ml
腺嘌呤溶液加入。（或将腺嘌呤直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压） 3. （蛋白胨 20g ；酵母提取物10g ；水大约925ml）混合后，调至PH至6.5，加水至935ml，
121℃高压15min。 注意：
? 高压的温度和时间不能太长与太高，121℃高压15min即可。 ? 可以在YPDA中加入20 g/L的琼脂，以配成平板。 ? 需要加kanamycin时，kan终浓度是10–15 mg/L。（kanamycin可以20℃贮存一个月，
加入到平板中去可以4℃贮存一个月。）
PEG/LiAc溶液（即配即用）
用下列贮存液来配制
50% PEG 3350：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。 10X TE buffer：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。 10X LiAc：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。 最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例）
终浓度 为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质 PEG 4000 40% 8 ml of 50% PEG TE buffer 1X 1 ml of 10X TE LiAc 1X 1 ml of 10X LiAc
无菌1x TE/LiAc溶液（用10x已灭菌的贮存液稀释）
10x TE buffer : 0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5(高压) 10x LiAc ： 1 M 用稀醋酸调节PH至7.5 高压
For β-galactosidase 滤膜实验 Z buffer溶液：
Na2HPO4? 7H2O 16.1 g/L （如换Na2HPO4? 14H2O 则 20.739 g/L） NaH2PO4? H2O 5.50 g/L （如换NaH2PO4? 2H2O 则 6. 21g/L） KCl 0.75 g/L MgSO4 ? 7H2O 0.246 g/L
最后调PH至7.0，高压，室温下可以贮存1年
X-gal 溶液：
X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20 mg/ml.，–20°C避光保存
Z buffer/X-gal 溶液：
100 ml Z buffer
0.27 ml β-mercaptoethanol （β-巯基乙醇） 1.67 ml X-gal 贮存液
ONPG 溶液：（即配即用）
ONPG溶于Z buffer中，终浓度4 mg/ml，调PH至7.0. 注意：
1. ONPG需要1～2h才能溶解 2. 每次用之前新鲜制备。
带有β-巯基乙醇的Z buffer
将0.27 mlβ-巯基乙醇加入100 ml Z buffer中即可
为了转化成功的小提示：
1.用一个1～3周龄（直径2～3mm）的菌落去接种液体培养基。如果菌落直径＜2mm，就用多几个菌落去接种。（也要大力涡旋使细胞团分散开来。） 2.如果过夜或者3hr之后的培养基明显成块，那么在使用之前一定要充分涡旋使培养基。 3.当通过离心收集细胞的时候，使用一个离心管即可，可以更好、更充分地收集细胞。 4.为了提高转化效率，要在1小时内准备酵母感受态细胞。如果有必要，可以在11步之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时，而活性却只有一点降低。
5.当进行通同转化的时候，诱饵（BD）质粒的量必须过度，而AD质粒的量要不足。
一般BD是AD的两倍。（李博士：此要求一般是针对文库筛选而言）
6.为了使菌落更好地生长，在涂布转化复合物到琼脂平板上时要直到所有液体被吸收。可以选择直径5mm的无菌玻璃珠（每一个100mm的平板用5-7个玻璃珠，直径150mm的平板用7-9个玻璃珠）去促进转化复合物的扩散，摇动的时候shake the plate back and forth—not round and round. （科内似并无此操作，而仅仅以玻棒涂布耳）
一. 复苏酵母：将酵母细胞接种到YPD固体培养基中培养，培养1-3周。（接种的时
候采取四区分区画线法）
二. 酵母感受态细胞置备和转化步骤：
1.取直径2～3mm的克隆接种到1ml的YPD或SD培养基中。 2.剧烈振荡或涡旋5min，使所有团块分散开来。
3.转移酵母液到50 mlYPD（？固体——也有液态的，未加入琼脂粉耳）或者SD培养基中。 4.置于30℃摇床中，以250 rpm的转速震荡培养基16～18h，直到OD600>1.5
5.转移部分过夜培养物（30ml）到300mlYPD培养基（？固体）中，使最终OD600 在0.2～0.3之间。
6.30℃摇床以230 rpm的转速震荡培养基3～4h直至OD为 0.4～0.6. （If the OD600 is < 0.4, something is wrong with the culture） 7.转移酵母液至50ml离心管中，1000g室温（20～21°C）离心5min 8.弃去上清，加入25～50ml无菌水或无菌的1x TE重悬酵母。 9.在1000g室温（20～21°C）条件下离心5min 10.轻轻倒出（弃去）上清
11.将细胞重悬于1.5ml新鲜准备的，无菌的1xTE/1xLiAc（在实验开始之前置备）
(至此酵母感受态细胞制备完毕)
12. 向无菌的1.5ml微量离心管中加入质粒DNA各0.1ug和0.1mg鲱鱼精载体DNA，之后轻轻混匀。
13.再向每管中加入0.1 ml 酵母感受态细胞，并且震荡混匀。 14.向每一管加入600 ul无菌PEG/LiAc溶液，高速振荡混匀。 15.30℃摇床以200 rpm的转速振荡培养30 min
16.向每一管加入70 ul DMSO 轻轻颠倒混匀，不要震荡。 17.42℃水浴热激15 min
18.取出后在冰上冷却1-2 min
19.1000 rpm室温离心5 min，弃去上清。 20.用0.5 ml 无菌的1×TE重悬酵母。
21.取合适体积的菌液（一般是100 ul）涂在选择性的SD培养基的平板上，在30℃培养箱中培养2-4天。（将克隆分成三份涂与不同平板上，1/3涂在SD/–His/–Leu/–Trp，1/3涂在SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp，最后1/3涂在SD/–Leu/–Trp上。） （科内仅涂布二缺与四缺板） （在21步之后涂一个二缺板和一个四缺板）因为在二缺板中AH109能生长，说明BD和AD已经转进去了。如果在四缺板中能生长，说明诱饵和文库肯定有作用，接着做一个α- gal实验。如果是将质粒转到Y187中的话，21步之后涂一个二缺板就行了。如果酵母能生长