发布时间 : 星期五 文章基因工程考试复习资料更新完毕开始阅读5e2b842c5b8102d276a20029bd64783e09127d3d
丰度的差别;而基因组文库在理论上均等的代表了所有的基因序列
C 从不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别表达基因；基因组文库不能
D 基因组文库由于含有不表达序列，因此比cDNA文库大
E mRNA在不同的组织之间存在风度的差异，因此cDNA文库的构建时如果mRNA少就比较困难，而基因组文库不存在这样的问题。
9.如何评价cDNA文库和基因组文库（公式，计算）：A 能代表整个基因组；稳定存在：N=Ln(1-p)/Ln(1-F);其中，N：要求克隆的数目，Ln为自然对数，P：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，，F：克隆片段的平均大小/生物基因组的大小，1/N：目的RNA在总RNA中出现的分数
B 评价cDNA文库的标准：N=Ln(1-P)/Ln(1-1/n)
10.mRNA完整性及其纯度检测方法：完整性,确保mRNA未被分解：a.利用无细胞翻译系统如麦胚抽提物或兔网织红细胞溶解产物看mRNA是否能够翻译，b.凝胶电泳分析，
mRNA500-8000bp,最大1.5kb-2.0kb。纯度检测方法：OD260/OD280~~2.0 OD260/OD230>2.0
11.cDNA文库中如何解决外源基因DNA片段的连接问题！！！：
a.对随机切割过的外源DNA片段按分子质量的大小进行分级分离，回收与载体装载量相适应的DNA片段，然后进行重组。b..用碱性磷酸酶去除外源DNA的5’磷酸基团 c.用末端转移酶在外源DNA的两个末端加上同聚物。
12.mRNA的分离方法;.利用3’末端polyA尾巴的特性； A.柱层析法：人工合成T，制成层析柱
B.磁珠分离：总RNA——》生物素标记的poly(T)——>加入磁珠与生物素抗体的复合物——》磁铁捕捉——》用一定盐溶液洗脱——》去离子水洗脱mRNA C.蔗糖溶液梯度离心
13 检测mRNA完整性：a.确保mRNA不被降解，b.使用无细胞的翻译系统，c.用电泳法分析mRNA：看是否在0.8-2.0kb的区段，是否集中大量mRNA.
无细胞翻译体系：又称无细胞蛋白质合成系统，是分子生物学中一种常规的表达系统，该系统可以用于蛋白质快速分析鉴定，基因转录和翻译的调控机理的研究以及分子间的相互作用的研究
14 基因克隆方法及原理：基因文库中获取；功能克隆；图位克隆。 图位克隆定义：根据目的基因在染色体的位置进行基因克隆的一种方法 图位克隆的原理：在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行最近目的基因或通过染色体登陆的方法最终找到该目的基因的克隆。
15 EST（表达序列标签）：基因序列中一段特异标记或表征该基因的序列，通常它含有足够的结构信息以显示该基因与其他基因的差异，长度一般在100-500kb
16 .酵母双杂交系统原理：在基因转录的过程中，有很多转录激活因子参与，大部分真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分隔开的结构域，一个是DNA特异结合域（BD)，一个是转录激活域（AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的，具有激活特定基因表达的激活因子必须同时具有这两个结构域，否则无法完成其激活功能。不同来源的激活因子的BD区与AD区结合后则能特异地激活BD结合基因的表达。据此可将两个待测蛋白（X和Y）分别与这两个结构域建成融合蛋白（BD-X和AD-Y)，并共表达与同一个酵母细胞内，如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD和BD形成一个完整的转录激活因子，并激活相应的报告基因表达，通过对报告基因的检测就能很容易的知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用，进一步可以用已知蛋白X作为诱饵，分离获得与之相互作用的蛋白质Y及其编码序列等。
17.TA克隆定义：
18差异筛选原理：需要两个细胞群体，一个目的基因正常表达，另一个不表达。制备两种细胞群体的mRNA提取物，以两种总mRNA（或cDNA拷贝）为探针，分别表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库进行筛选，挑选含有目的基因的探针有杂交信号，不含目的基因的探针没有杂交信号的菌落供进一步研究。
19.转座子标签法：原理：当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失适，并诱导产生突变型而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可恢复，遗传分析可确定某基因的突变是否是由转座子引起，由转座子引起的突变便可以转座子的DNA片段为探针，从突变株的基因组文库中调出含有该转座子的DNA片段，并获得含有部分突变株DNA序列的克隆，进而以该DNA为探针，筛选野生型的基因组文库，最终获得完整的基因。
20.序列克隆（重点）：
八
一，常用动物的标记基因
1,胸苷激素（tk）通过TK合成胸苷酸筛选氨基嘌呤（抑制嘌呤和胸苷从头合成) 2，二氢叶酸还原酶（DHFR）通过DHFR变体酶抗Mtx筛选
3.氨基糖苷磷酸转移酶（DHFR）利用APH钝化G418，来筛选G418（抑制蛋白质的合成） 4.潮霉素B磷酸转移酶(XGPRT)，利用XGPRT从黄嘌呤合成GMP筛选霉芬酸（抑制鸟苷酸从头合成）
5.天冬酰胺合成酶（AS） 6.腺苷脱氨酶（ADA） 二，转染动物细胞的方法 <1>机械化方法
1，裸露DNA直接注射——适合于基因表达技术 2，电穿孔 3，显微注射 4，基因枪法 <2>化学方法 1.磷酸钙共沉淀法 2.DEAE-葡聚糖法 3.脂质体介导法 <3>生物方法 1.转导
三，共转染现象：在磷酸钙沉淀物中，两个物理上毫无联系的DNA分子混合物往往能侵染同一个细胞产生共转染的现象。
四．基因治疗（gene theraphy）：将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗的目的。 五．应用转基因动物培育的方法： 1， 获得胚胎 2，受精卵移植
3， 显微注射，将目的基因在显微镜下通过玻璃微管向胚细胞注射500-600拷贝基因
九
一，基因沉默. Gene Silencing：外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象。