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三七茎叶中叶苷及黄酮的同步分离工艺
研究
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
【摘要】 目的探索分离三七茎叶中的叶苷和总黄酮的工艺条件及参数。方法以静态饱和吸附量、动态比吸附量、比洗脱量为考察指标，比较不同大孔树脂富集纯化三七茎叶叶苷和总黄酮的性能，并对最佳树脂纯化工艺进行筛选。结果AB-8树脂综合性能最佳，其吸附分离工艺条件为：上样液浓度为叶苷1.806 0 mg/ml,总黄酮0.7852 mg/ml，上样液以1.0 BV/h吸附流速上样，纯水冲洗，60%乙醇洗脱后，再用95%乙醇洗脱。结论经大孔树脂纯化后的三七茎叶有效部位中，总黄酮加叶苷的质量分数达90%，说明该纯化工艺是可行的。
【关键词】 三七茎叶； 大孔吸附树脂； 有效部位
三七茎叶为五加科植物三七Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen的地上部分，三七叶苷及黄酮是三七茎叶中的有效部位。三七总黄酮与皂苷合用，生理活性最强，分开使用则证明总黄酮能显著增加心肌冠脉流量［1］。现代研究表明，三七叶苷有延年益寿和增强机体活力的作用［2］；三七黄酮类成分具有增加冠状动脉血流、降低心肌耗氧
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量、抗心律失常、抗氧化、抗衰老以及增强机体免疫力等功能，具有治疗老年性痴呆症的可能，其在心脑血管疾病防治及保健等方面有广泛的应用前景［3］。三七茎叶在三七道地产地文山资源丰富，大约每年可收获10 000 t，本实验以三七茎叶为原料，以提取物收率（提取物质量/原料质量）和叶苷、总黄酮的纯度为考察指标，采用醇提-树脂法对三七叶苷及黄酮的提取分离与纯化工艺进行了研究，以期为三七茎叶的开发提供依据。 1 材料
三七茎叶购自云南文山三七国际交易市场；人参皂苷Re对照品购于中国生物制品检定所；AB-8树脂为天津南开大学化工厂产品，HPD-100为河北沧州宝恩化工有限公司产品，D101-大孔吸附树脂(华北地区特种化学试剂开发中心)；其他试剂均为分析纯。岛津2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海一恒科技有限公司），R201D-Ⅱ旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司）。 2 方法与结果 2.1 工艺流程见图1。 2.2 三七叶苷的含量测定［2］
2.2.1 标准溶液的配制精密称取人参皂苷Re对照品0.020 0 g用甲醇溶解并定容至10.0 ml，即每毫升含人参皂苷Re 2.0 mg。 2.2.2 样品测定精密吸取待测液1.0ml于蒸发皿，置于60℃水浴挥干；同样精确吸取人参皂苷Re标准溶液0.1 ml于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干。在已挥干的蒸发皿中，分别准确加入0.2 ml质量
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分数为5%的香草醛冰醋酸溶液，0.8 ml高氯酸，混匀后移入5 ml具塞刻度离心管中；于60℃水浴加热10 min，取出后用流水冷却，再准确加入5.0 ml冰醋酸溶液摇匀，以1 cm比色池于560 nm波长处测定吸收值［4］，并通过下式计算求出含量。 叶苷含量（mg/ml）=对照品量×A样/A对样品体积
式中：A样，样品吸收值；A对，对照品吸收值；对照品量，标准管人参皂苷Re的量(mg)；样品体积(ml)。
2.3 黄酮含量测定［4］采用分光光度计法测定总黄酮含量，即利用黄酮类化合物与铝盐反应，产生红色络合物，以芦丁为对照品于500 nm波长处测定吸收值。
2.3.1 标准溶液的配制［5］精密称取于120℃干燥至恒重的芦丁对照品48.35 mg置于50 ml容量瓶中，加乙醇溶解至刻度，摇匀，精确吸取此溶液10.0 ml置于50 ml容量瓶中，再加水至刻度，摇匀，即得标准溶液。
2.3.2 标准曲线的制作精密吸取芦丁标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml分别置于25ml容量瓶中，各加水至6 ml，再加入5%的亚硝酸钠溶液1.0 ml，混匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液1.0 ml，混匀，放置6 min，加入4%氢氧化钠10.0 ml再加水至25 ml，放置15 min（不加芦丁作空白对照）。按分光光度计法在500 nm波长处测定吸收值。所取标准溶液的浓度和吸收度数据经回归处理，得回归方程：A= 0.219 6C－0.011 2，其线性范围为0～0.6 mg 相关系数r=0.999 3。
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2.4 上柱液的制备及预处理取干燥的三七茎叶，用70%乙醇溶液为溶剂，料液比为1∶50（g∶ml），回流提取1.5 h，提取2次，合并提取液，通过减压蒸馏回收乙醇溶液，得到的固形物用一定量的热蒸馏水溶解、过滤后作为样品溶液，总黄酮浓度为1.570 4 mg/ml，叶苷浓度为3.6120 mg/ml。 2.5 不同型号树脂筛选
2.5.1 大孔吸附树脂预处理先将树脂放在水中浸泡，除去浮在表面的树脂(反复几次)，再用95%乙醇浸泡24 h，使树脂充分溶胀，湿法装柱。用95%乙醇以2 BV/h的流速通过树脂层，流至流出液加蒸馏水不变白色浑浊为止。再用蒸馏水以同样流速洗尽乙醇。将5%的盐酸溶液以4～6 BV/h流速通过树脂层，并浸泡2～4h，然后用蒸馏水以同样流速洗至中性，再用2%的NaOH溶液以4～6 BV/h流速进行碱洗，用去蒸馏水洗至中性即处理完毕。
2.5.2 静态吸附试验由于三七叶苷和黄酮的极性较弱，根据相似相溶原理，弱极性的化合物更易被弱极性的树脂所吸附，故本实验选择D101（非极性）、AB-8（弱极性）、HPD-100（非极性）作为备选树脂。在带塞的锥形瓶中，各加入取处理好的树脂1 ml和150 ml上柱液于25℃恒温摇床中，振荡24 h，充分吸附后，过滤，取滤液，分别按“2.2”和“2.3”项下方法测定样品吸附前后叶苷和总黄酮的浓度,按下式计算各种树脂的静态饱和吸附量(mg/ml湿树脂)。 吸附量（mg/ml）=C0-CrW树脂×V
式中C0和Cr分别为吸附前后提取液中的质量浓度(mg/ml)，W树脂