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4．Small RNA技术路线
4．1 项目描述
对18个RNA样品进行检测，样品检测合格后采取以下技术路线对Small RNA进行测序：Small RNA测序样品制备（默认18-30 nt，可根据研究开发需要适当调整切胶范围，需进行个性化评估）――上机测序（每个样本产生不低于15-20M的clean reads）――生物信息学分析。
发育节点: 4龄期L1 6龄期L2 蛹期L3 1年成虫L4 2年成虫L5 4年成虫L6 原始重复数据：(1-3) (1-3) (1-3) (1-3) (1-3) (1-3)
Small RNA合并：Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y1-Y6合并=U 注释比对库 Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 U 对比15次： Y1-Y2，Y1-Y3，Y1-Y4，Y1-Y5，Y1-Y6；Y2-Y3，Y2-Y4，Y2-Y5，Y2-Y6；Y3-Y4，
Y3-Y5，Y3-Y6；Y4-Y5，Y4-Y6；Y5-Y6
1）分析流程思路：A）与首选物种的前体比对（首先将测序数据比对miRabse的上报到的前体序列进行比对，这个非常重要的一个优势就是可以在我们的数据分析过程中，能够快速的发现已经报道的miRNA的新的3P或者5P序列）。B）与miRBase报道的成熟体比对。C）与参考基因组比
该流程
要修改
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2）分析顺序：6个发育阶段的small RNA测序数据─→按照miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，
microRNAs，miRNAs，scRNA这9个类型区分到6个发育阶段─→建54个数据包，1个发育阶段建9个─→再分析。
4．2 生物信息学分析内容 注意：除常规分析项外，下述（也包含常规分析）必须全部做 1．基本分析 尽可能区分6个发育阶段进行分析
1）数据产出统计，对原始测序数据去接头，去低质量，去污染，提供分析数据及展示图：原始序列通过Illumine FastQC进行质量评价，获取Q20、Q30数据后，通过一系列数据处理将由于样本制备、测序结题、非典型miRNA特征序列（垃圾序列）及测序仪器光学数码处理而产生的非纯序列（N特征序列）进行整理，比对常见的RNA序列，如miRNA序列，RFam(piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNAs，
miRNAs，scRNA)和重复序列（详见下述“4”），进行归
类、提供图表
2）Rfam 数据库比对：详见“3. small RNA分类” 3）Repbase数据库比对：详见“3. small RNA分类” 4）Clean RNA长度分布统计：对整理（过滤）后的clean数据的总数（Total）及种数（Unique）进行了长度分布统计。如右图所示
5）Small RNA的检出和发现：详见“5．新Small RNA预测”
6）miRNA检出率统计：计算本次实验中的检出频率，并绘制维恩图。
7）Small RNA长度统计：详见“2．small RNA 的长度分布等” 8）Small RNA差异表达分析
（1）差异表达分析：根据实验设计不同，采用合适的差异检验方法筛选差异显著基因，
例如Fisher精确检验、卡方（2*2）（N*N）、T检验以及ANOVA等算法。分别采用筛选阈值为P值小于0.1、0.05以及0.01进行差异表达分析。
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（2）差异基因上下调频数统计：分别对18组数据基因差异基因统计，并对6个时间段趋
势统计分析。并绘制趋势图
（3）差异基因表达水平聚类分析：对18组数据进行聚类分析并绘制热图。
（4）差异基因维恩图：根据实验方案对18组数据在P值小于0.1、0.01、0.05三个条件
下绘制维恩图。
? Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各发育节点的差异表达Venn 图（韦恩图绘制策略：Y 1-U 、
Y3-U、Y3-U、Y4-U、Y5-U、Y6-U）；
? miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNAs，miRNAs，scRNA，
siRNA暂不做）不同类型的差异表达Venn 图；
9）miRNA成簇分析：有一些miRNA在基因组中成簇分布，这些miRNA同步由同一条初级体miRNA
转录，他们转录成一个多顺反子结构，使他们具有协同活性。通过成簇分析，可以在cluster水平考察miRNA的差异表达情况。详见“7．已知miRNA （包括已知和预测出的miRNA）的家族分析”
10）miRNA进化分析：MiRNA具有高度保守性（利用
miRBase、miRNAMap、miRGe、piRNA、TIGR、Rfam等数据库，及Vienna包与Mfold包），对选定物种进行miRNA
保守性分析，对于测序得到的miRNA及其他物种中出现的频率进行数目统计并绘制柱状图。提供分析数据及展示图
? 同源性/保守性分析。
11）miRNA种子序列分析：界定2-7序列一直为同一调控家族。对昆虫的种子序列家族进行
归类。与 miRBase、mRNA/EST、rRNAetc、http://csrdb.ucdavis.edu/smrnas，
http://plantgrn.noble.org/psRNATarget，http://starbase.sysu.edu.cn/degradomeSeq.php，
http://www.mirbase.org（所有植物、动物的Small RNA数据库）等等数据库比对。维也纳软件包中的RNA二级结构程序包RNAlib (Vienna 1.3 RNAsecondary structure programming library)评估miRNA-靶基因二聚体的结合能等
12）Small RNA 碱基偏向性分析： GC/AT 含量分布图；
碱基组成、质量分布，原始碱基数（bp），高质量碱基数（bp），碱基组成比率分析 13）对实验得到的piRNA进行统计分析
14）差异基因靶基因预测，并对预测得到的靶基因进行
GO、KEGG分析及聚类分析（非模式物种靶基因预测过程如右图所示）。详见“6．靶基因预测、GO功能分类、聚类分析” ──────────→
2．small RNA 的长度分布。按照6个样品，分别统计分析
除常规程序性分析外，提供以下分析数据及展示图：
GO和KEGG enrichmentFiteringmiRNAtargetsTagetfuntionannotationTargetScantarget predictionSigni?cant Diff miRNAsmRNAgetorfBLASTUTR_SequencesRef species GO，KEGG DatabaseBLASTGO DatabaseKEGG Database（1）miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNAs，miRNAs，scRNA分别在
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6个发育阶段的比率统计；
（2）U 数据的miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，
microRNAs，miRNAs，scRNA，siRNA暂不做）长度分布。 （3）Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各发育节点的miRNA，piRNA，
rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNAs，miRNAs，scRNA，siRNA暂不做）长度分布。
3．small RNA分类（① small RNA分类应该与转录组COG分类和GO分
类有对应关系，以便于进行转录组、small RNA、蛋白质组的关联分
析。② 应按照miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNAs，miRNAs，scRNA，siRNA暂不做）类型，进行分类→再细分。③ 应特别关注其分析方法和数据库→http://wenku.http://www.china-audit.com//view/096023 3987c24028915fc3ec.html）除常规性分析外，提供以下数据及图：
1）比对分析，提供分析数据及展示图
与 miRBase、mRNA/EST、rRNAetc、http://csrdb.ucdavis.edu/smrnas，http://plantgrn.noble.org/psRNATarget，http://starbase.sysu.edu.cn/degradomeSeq.php，http://www.mirbase.org（所有植物、动物的Small RNA数据库）等等数据库比对。用所有物种的Small RNA进行比对（或再用动物的Small RNA对比对结果进行筛选和矫正），进行Small RNA的分类、鉴定。提供分析数据和展示图（目的：鉴定了多少miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNAs，miRNAs，scRNA，）
除常规程序性分析外，提供以下分析数据及展示图：
? 确定Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6、U 各自比对鉴定出的Small RNA； ? Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6、U 各自鉴定出的Small RNA间的差异比较；
2）各发育节点miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNAs，miRNAs，scRNA，
siRNA暂不做）等Small RNA的组成及其差异分析
（1）Rfam等数据库（至少2个数据库）比对（一系列non-coding RNA分析）：选取Rfam
数据库来注释测序得到的小RNA序列，对其中的miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，
microRNAs，miRNAs，scRNA分别进行总测序数据（总数）以及Unique数据（种数）统
计，并区分出6个时间点中均有表达的共有序列、特异性表达的特有序列分析，提供分析数据及展示图。【4龄期L1 6龄期L2 蛹期L3 1年成虫L4 2年成虫L5 4年成虫L6 六个时间段分别统计】。具体内容如下：
? U 数据 miRNA，piRNA， rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNAs，miRNAs，scRNA，siRNA暂不做）组成分析，提供饼图和数据；
? Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各发育节点miRNA，piRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNAs，miRNAs，scRNA的组成分析，时序变化规律；
? Y 1、Y 2、Y 3、Y 4、Y 5、Y 6各发育节点共有序列及特有序列分析； ? 各发育节点差异序列表达趋势分析miRNA-STC，差异筛选； ? Small RNA 表达水平差异方差分析；
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