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双抗体夹心ELISA法检测CEA
一、实验目的
1. 阐述酶联免疫吸附测定(ELISA)的原理，列举ELISA类型 2. 完成ELISA的基本操作 3. 学会分析实验结果
4. 能根据需要设计相应的ELISA实验流程 二、实验原理
酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。
ELISA 类型：直接法（一步法）；间接法（间接ELISA、双抗体/原夹心法，竞争性ELISA、BAS-ELISA）。
1. 已知的抗原或抗体结合到特定的固相载体表面（聚苯乙烯微量反应板，利用蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附），并保持其免疫学活性。
将抗原或抗体固定在固相载体表面的过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。
包被用抗原分为——天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。
2. 抗原抗体的特异性结合：可用于以已知抗原检测未知抗体或以已知抗体检测未知抗原。本实验采用以已知抗体检测未知抗原。
3. 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。结合在固相载体上的酶量与标本中待测抗原或抗体的量成正比。
（制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。抗原必须是高纯度的。）
4. 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果,还可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶催化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定（30min内），否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
ELISA法中所用的酶要求纯度高，催化反应的转化率高，转一性强，性质稳定，继续保留它的活性部位和催化能力。
HRP的色原底物：
OPD（邻苯二胺）被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯(DAB）。缺点：实际工作中，用强酸尤其
是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化OPD而产生非酶催化的DAB的结果。改进：在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了OPD的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。
TMB（四甲基联苯胺）是一种优于OPD的新型HRP色原底物。其氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，过氧化氢溶液和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌。使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min，但随后本底显色就不断加深。
比较：TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则可反应显色迅速消退。TMB虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了OPD而成为HRP最为常用的色原底物。本次实验所使用的也是TMB。
5. 双抗体夹心ELISA基本过程：抗体包被、洗涤、封闭结合位点、结合抗原、洗涤、结合酶标抗体、洗涤，加底物反应、显色并读数。 三、实验材料
1. 酶标反应板（包被有抗CEA抗体）
2. CEA标准品 （0ng/ml， 5ng/ml， 10ng/ml，20ng/ml， 40ng/ml， 80ng/ml） 3. 样品1和样品2
4. 酶标抗体 （酶结合物）
5. 底物液A和底物液B（显色剂A和B） 6. 终止液 7. 洗涤液 四、实验步骤
1.将梯度标准品和待测样品分别加100μl于每孔，37℃（湿盒或封口）30min。 2.用洗涤液洗涤4次后，加入酶结合物100 μl于每孔，37 ℃湿盒或封口，30min。 3.洗涤4次后，分别加显色剂A和B各1滴混匀， 37 ℃湿盒或封口，15min （避光）。 4.加终止液1滴，肉眼观察结果并读取OD450值。 （洗涤液的量逐渐递增） 注意事项
包被：样品若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。 （常规包被2-8℃冰箱过夜）试剂盒要注意保质期。
孵育：1) 贴封片或加盖，置湿盒； 2) 按说明步骤严格控制操作时间。
洗板：保证洗液注满各孔，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干。若用洗板机，请保持洗板针畅通。
显色：显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂（AB液临时混合） 终止：在加终止液时应避免产生气泡。
读板：若用机器读板，应保证酶标板底部清洁。 五、实验数据处理和分析
肉眼观察可以发现样品的浓度比较接近2~3管，可推测浓度在5~10之间。 原始数据： A B C D E F G 管号 标准品浓度（ng/mL） 0 OD450nm 0.068 OD630nm OD450-630 标准曲线
0.042 0.026 5 10 20 40 80 0.256 0.48 0.831 1.338 样品 2.735 0.416 0.048 0.044 2.687 0.372 H 样品 0.412 0.041 0.371 0.037 0.068 0.043 0.043 0.219 0.412 0.788 1.295 标准品OD值标准曲线 3 OD值（450-630） 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 20 40 y = 0.0326x + 0.0614 R2 = 0.9974 60 80 100 标准品浓度ng/ml 分析：两次样品是同种，结果OD值也近似，误差为（0.372-0.371）/0.372=0.27%，所以结果可靠，选择将两次样品的OD值取平均为0.3715，代入标准曲线得x值为9.512，所以所测样品的浓度为9.512ng/ml。
本次的样品为试剂盒的质控品1：10ng/ml±15%，本次实验测出结果为9.512ng/ml，与10的误差为（10-9.512）/10=4.88%<15%，所以本试剂盒效果很好，可以使用其检测病人的CEA水平，CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。CEA升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性结肠炎等疾病，15%～53%的病人血清CEA也会升高，所以CEA不是恶性肿瘤的特异性标志，在诊断上只有辅助价值。此外，血清CEA水平与大肠癌的分期有明确关系，越晚期的病变，CEA浓度越高。 六、思考题
1.抗体是如何包被在固相载体上的？ （本试剂盒使用的是CEA单抗）。IgG与聚苯乙烯疏水基团之间有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，不会影响后续抗原抗体反应。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液，须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性；腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
2.封闭的作用？所有的ELISA固相均需封闭吗？
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。
并非所有的ELISA固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。当双抗体夹心法中，如果酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗
腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，已经起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的。所以我认为，如果经历过一次不封闭而背景并不高的话，可以考虑再次使用同一套抗原抗体的时候也不封闭，但是在用不同试剂的时候还是封闭比较稳妥。
3.抗原结合的特点？
抗原抗体反应的特点主要有三性：即特异性、比例性、可逆性。本实验利用了前两个特性——特异性是抗原抗体反应的最主要特征，这种特异性是由抗原决定簇和抗体分子的超变区之间空间结构的互补性确定的。这种高度的特异性在传染病的诊断与防治方面得到有效的应用；比例性是指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，在抗原抗体比例相当或抗原稍过剩的情况下，反应最彻底，形成的免疫复合物沉淀最多、最大。而当抗原抗体比例超过此范围时，反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体反应。
4.为何要有洗涤步骤？
抗体包被后洗涤是为了洗去未吸附的抗体；加入待检样品后洗涤是为了洗去未结合的抗原；加入已知酶标抗体后洗涤是为了洗去未结合的酶标抗体。所有的洗涤步骤都是为了防止特异性反应背景过高，完全结合上的抗原/抗体是不会被PBST洗下来的，根据我以前实验中的经验，短时多次的洗涤效果最好。
5.颜色反应为何能反映出抗原的量？如何避免出现显色深度与抗原量成反比的情况？ 因为颜色反应的深浅是与底物量成正比的，而底物的量即抗原抗体结合物的量，在前带中，结合物的量是与抗原的量成正比的，所以颜色反应能反映出抗原的量。所以在控制量的时候，应注意使抗体过量一些使其处于前带期。而如果处于后带的位置，就会使得显色深度与抗原量成反比。
6.为何要做标准曲线进行定量？
每次实验的条件和仪器状态都是不一样的，所以在测定样品的时候需要与标准品在同一个状态下，同一种条件进行实验，以作为比照。而制定标准曲线是为了使测定结果更加精确，因为单纯用标准品和样品进行比例计算，得出来的误差是相当大的，所以多取几个点做出拟合曲线之后再在曲线上找点会使得结果更加精确。所以每次都要有对照，而且每次都要做标准曲线。
7.封口和湿盒比较？
湿盒的作用更全面一些，既有保湿的作用，又可以避光；而只封口避光效果会不太理想。而且我认为封口后37℃时，会有一些液体蒸发后冷凝，停留在封口纸上，依然会导致反应管里液体减少，而湿盒是使得管内外湿度相当，效果会好一些。
8.洗板机的工作原理。
洗板机的工作原理是将微型空气压缩机用于洗板机中，利用空气压缩机产生的正负气压直接进入洗液瓶和废液瓶，产生瓶内压力或真空，从而通过冲洗头完成吸注液功能，残液量少，使用安全可靠。用户在每天使用洗板工作完毕后，选择冲洗栏内的冲洗键即可进行冲洗，之后把洗板机内部的洗液转换成蒸馏水，完毕之后返回主菜单。我认为冲洗的过程很重要，洗板机不如一次性枪头，一定要冲洗干净才能保证不污染下次实验。