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土壤全氮测定 ——半微量开氏法
【方法原理】
样品在加速剂的参与下，用浓硫酸消煮时，各种含氮有机物，经过复杂的高温分解反应，转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以标准酸溶液滴定，求出土壤全氮量（不包括全部硝态氮）。
包括硝态和亚硝态氮的全氮测定，在样品消煮前，需先用高锰酸钾将样品中的亚硝态氮氧化为硝态氮后，再用还原铁粉使全部硝态氮还原，转化成铵态氮。
在高温下硫酸是一种强氧化剂，能氧化有机化合物中的碳，生成CO2，从而分解有机质。
2H2SO4?C????2H2O?2SO2??CO高温2?
样品中的含氮有机化合物，如蛋白质在浓H2SO4的作用下，水解成为氨基酸，氨基酸又在H2SO4的脱氨作用下，还原成氨，氨与H2SO4结合成为硫酸铵留在溶液中。
Se的催化过程如下：
2H2SO4?Se???H2SeOH2SeO3?2SO2??H2O ?H2O3????SeO2
SeO2?C???Se?CO2?
由于Se的催化效能高，一般常量法Se粉用量不超过0.1～0.2g，如用量过多则将引起氮的损失。
(NH4)2SO4?H2SeO3(NH4)2SeO3???(NH4)2SeO3?H2SO4
3???2NH3?Se?9H2O?2N2?
以Se作催化剂的消煮液，也不能用于氮磷联合测定。硒是一种有毒元素，在消化过程中，放出H2Se。H2Se的毒性较H2S更大，易引起人中毒。所以，实验室要有良好的通风设备，方可使用这种催化剂。
4CuSO4?3C?2H2SO4???2Cu2SO4?4SO2??3COCu2SO4?2H2SO4???2CuSO?2??2H2O?
4?2H2O??SO2?
褐红色 蓝绿色
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当土壤中有机质分解完毕，碳质被氧化后，消煮液则呈现清澈的蓝绿色即“清亮”，因此硫酸铜不仅起催化作用，也起指示作用。同时应该注意开氏法刚刚清亮并不表示所有的氮均已转化为铵，有机杂环态氮还未完全转化为铵态氮，因此消煮液清亮后仍需消煮一段时间，这个过程叫“后煮”。
消煮液中硫酸铵加碱蒸馏，使氨逸出，以硼酸吸收之，然后用标准酸液滴定之。 蒸馏过程的反应：
(NH4)2SO4?2NaOH???Na2SO4?2NH3?2H2O
NH2?H2O???NH4OH4
)2SO4?H2ONH4OH?H3BO3?H2SO4???(NH
滴定过程的反应：
2NH4·H2BO3?H2SO4???(NH4)2SO4?H2O
【主要仪器】
消煮炉；50ml或100ml开氏瓶；半微量定氮蒸馏装置；150ml锥形瓶；5ml或10ml半微量滴定管。 试剂：
（1）硫酸。 ρ=1.84g·ml-1，化学纯；
（2）10mol·L-1NaOH溶液。 称取NaOH（AR）400g（工业用固体NaOH，称420g），于硬质玻璃烧杯中，加蒸馏400ml溶解，不断搅拌，以防止烧杯底角固结，冷却后倒入塑料试剂瓶，加塞，防止吸收空气中的CO2，放置几天待Na2CO3沉降后，将清液虹吸入盛有约160ml无CO2的水中，并以去CO2的蒸馏水定容1L加盖橡皮塞（浓度约为40% W/V）。
（3）甲基红—溴甲酚绿混合指示剂。即0.099g溴甲酚绿和0.066g甲基红于玛瑙研钵中，加少量95%酒精，研磨至指示剂完全溶解，用95%乙醇定容100ml。此指示剂变色范围pH 4.4(红)―5.4（蓝），贮存期不超过2个月。
（4）20g·L-1 H2BO3—指示剂[注1]。
称取硼酸（分析纯）20g溶于约950ml水中，加热搅动直至H3BO3溶解，冷却后，加入混合指示剂20ml混匀（每10mlH3BO3加入2ml指示剂），并用稀酸或稀碱调节至紫红色（pH约4.5），加水稀释至1L混匀，贮存在塑料瓶中备用。宜现配。
（5）混合催化剂。K2SO4:CuSO4:Se=100:10:1即100g K2SO4（化学纯）、10g CuSO4 ·5H2O
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（化学纯）、和1g Se粉混合研磨，通过80号筛充分混匀（注意戴口罩），贮于具塞棕色磨口瓶中。消煮时每毫升H2SO4加0.37g混合加速剂。
（6）高锰酸钾溶液。25g高锰酸钾（分析纯）溶于500ml无离子水，贮于棕色瓶中。 （7）1:1硫酸（化学纯、无氮、ρ=1.84g·ml-1）。硫酸与等体积水混合。 （8）还原铁粉。磨细通过孔径0.15mm（100号）筛。 （9）辛醇。
（10）0.01 mol·L-1（1/2H2SO4）标准液。量取H2SO（化学纯、无氮、ρ=1.84g·ml-1）2.83ml，4
加水稀释至5000ml，然后用标准碱或硼砂标定之，得0.02 mol·L-1（1/2H2SO4）标准溶液。将0.02 mol·L-1（1/2H2SO4）标准溶液用水准确稀释一倍。
或盐酸标准溶液：0.02mol/L，每1000ml水中加入1.8mlHCl（ρ=1.19 g·ml-1），混匀。 标定：平行3份，空白3份。称取1.9068g硼砂[注2]（Na2B4O7·10H2O），精确至0.0001g，加水溶解后稀释至500ml，得0.0500mol/L硼砂标准溶液。吸取20.00ml硼砂标准溶液置于150ml锥形瓶中，加1滴甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，用盐酸标准溶液滴定至溶液由蓝色变为紫红色为终点。同时做空白试验。盐酸标准溶液的浓度按下式计算：
C(HCl)?C1?V1V2?V0
式中：
C—盐酸标准溶液浓度，mol/L；
C1—硼砂标准溶液浓度（0.02000），mol/L； V1—硼砂标准溶液体积，ml； V2—盐酸标准溶液用量，ml；
V0—空白试验消耗盐酸标准溶液体积，ml； 【测定步骤】
（1）称取通过孔径0.149mm筛（即100目筛）
[注3]
风干土样1.0000g（含氮约1mg）
[注4]
，
同时测定土样水分含量，最后换算成烘干样计算结果。
（2）土样消煮[注5]
①不包括硝态氮和亚硝态氮的消煮：将土样小心移入干燥的消煮管底部，加少量无离子水（0.5～1ml）湿润土样后[注6]，加入加速剂1.85g和浓硫酸5ml，摇匀，将开氏瓶倾斜置于变温电炉上，最初宜用低温，待瓶内无泡沫发生（约10min～15min），提高温度（375℃，4h）
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使消煮的土液保持微沸，加热的部位不超过瓶中的液面，以防瓶壁温度过高而使铵盐受热分解，导致氮素损失。消煮的温度以硫酸蒸气在瓶颈上部1/3处冷凝回流为宜。待消煮液和土粒全部变为灰白稍带绿色后，再继续消煮1h。（个别土样如果分解困难，消煮液转清亮的过程较慢，必须延长半小时左右。）消煮完毕，取下凯氏瓶冷却，准备蒸馏。在消煮土样的同时，做两份空白测定，除不加土样外，其他操作皆与测定土样相同。
②包括硝态氮和亚硝态氮的消煮：将土样送入干燥的开氏瓶（或消煮管）底部，加高锰酸钾溶液1ml，摇动开氏瓶，缓缓加入1:1硫酸2 ml，不断转动开氏瓶，然后放置5min，再加入1滴辛醇。通过长颈漏斗将0.5g(±0.01g)还原铁粉送入开氏瓶底部，瓶口盖上小漏斗，转动开氏瓶，使铁粉与酸接触，待剧烈反应停止时（约5min），将开氏瓶置于电炉上缓缓加热45min（瓶内土液应保持微沸，以不引起大量水分丢失为宜，205℃）。停火，待开氏瓶冷却后，通过长颈漏斗加加速剂2g和浓硫酸5ml，摇匀。按上述①的步骤，消煮至土液全部变为黄绿色，再继续消煮1h。消煮完毕，冷却待蒸馏[注7]。在消煮土样的同时，做两份空白测定。
（3）氨的蒸馏
①蒸馏前先检查蒸馏装置是否漏气，并通过水的馏出液将管道洗净。
②待消煮液冷却后，用少量无离子水将消煮液定量地全部转入蒸馏器内，并用水洗涤开氏瓶4～5次（总用水量不超过30～35ml）。若用半自动式自动定氮仪，不需要转移，可直接将消煮管放入定氮仪中蒸馏。
在150ml锥形瓶中，加入5ml H2BO3—指示剂混合液 [注8]，放在冷凝管末端，管口置于硼酸液面以上3～4cm处[注9]。然后向蒸馏室内缓缓加入20 ml 10 mol·L-1NaOH溶液，通入蒸汽蒸馏，待馏出液体积约50ml时，即蒸馏完毕。用少量已调节pH至 4.5的水洗涤冷凝管的末端。
③用滴定馏出液由蓝绿色至刚变为红色。记录所用酸标准溶液的体积（ml）。空白测定所用酸标准溶液的体积，一般不得超过0.4ml。 【结果计算】
?V土壤全N量（g·kg-1）=式中：
?V0??c(12H2SO4)?14.0?10m?K?3?10
3V—滴定试液时所用酸标准溶液的体积，ml； V0—滴定空白时所用酸标准溶液的体积，ml； c—0.01 mol·L-1（1/2H2SO4）或HCl标准溶液浓度；
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m—风干土质量； K—土壤水分系数。
两次平行测定结果允许差为0.005%。 【注释】
1. 硼酸指示剂溶液最好在使用时混合，如混合过久，可能有终点不灵敏的现象发生。
若滴定时酸的浓度大于0.01N，亦可用另一硼酸指示剂溶液，即：称取硼酸（AR）20g溶于约950ml水中，加热搅动直至H2BO3溶解，冷却后，加入混合指示剂（0.5g溴甲酚绿和0.1g甲基红溶于100ml乙醇中）5ml，然后以0.1N NaOH或0.1N HCl调节溶液至紫红色（紫红色pH约4.5，为微紫红色pH约4.8），加水稀释至1L混匀。 2. 标定用硼砂（Na2B4O7·10H2O）必须保存于相对湿度60%～70%的空气中，以确保硼
砂含有10个化合水，通常可在干燥器的底部放置氯化钠和蔗糖的饱和溶液，此时干燥器中空气的相对湿度即为60%～70%。
3. 开氏法测定全氮样品必须磨细通过100孔筛，以使有机质能充分被氧化分解。 4. 一般应使样品中含氮量为1.0～2.0mg，如果土壤含氮量在2 g·kg-1以下，应称土样
1g；含氮量在2.0～4.0 g·kg-1者，应称土样0.5～1.0g；含氮量在4.0g·kg-1以上，应称土样0.5g。
5. 一般土壤中硝态氮、亚硝态氮含量不超过全氮量的1%，可以忽略不计。
6. 对于粘质土壤样品，在消煮前须先加水湿润使土粒和有机质分散，以提高氮的测定效
果。但对于砂质土壤样品，用水湿润与否并没有显著差别。但是，包括硝态氮和亚硝态氮的消煮不加入水，因为水的存在会影响NO3-与水杨酸的作用。
7. 若不能及时分析消煮液，可以将全部消煮液加20ml水溶解，转入50ml容量瓶，以少
量蒸馏水冲洗开氏瓶3次，都倒入50ml容量瓶，最后定容并充分混匀，低温避光保存。 若消煮液冷却后凝结，是消煮过程中消煮液水分损失较多所致，会给后续操作带来不便，可补充加入少量去离子水，加热使之溶解。
8. 硼酸的浓度和用量以能满足吸收NH3-为宜，大致可按每1ml10g·L-1 H2BO3能吸收氮（N）
0.46mg计算，例如20 g·L-1 H2BO3溶液5ml最多可吸收的N量为5×2×0.46=4.6mg。因此，可根据消煮液中含氮量估计硼酸的用量，适当多加。
9. 在半微量蒸馏中，冷凝管口不必插入硼酸液中，这样可防止倒吸减少洗涤手续。但在
常量蒸馏中，由于含氮量较高，冷凝管须插入硼酸溶液，以免损失。
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