发布时间 : 星期三 文章高效纤维素降解菌的选育 - 图文更新完毕开始阅读2c5250d249649b6648d747df
武汉科技大学本科毕业论文
素作用较强的是木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penieillium)和枝顶孢霉属(Aeremonium)的菌株，其中真菌木霉属是迄今所知形成和分泌纤维素酶系成分最全面、获利最高的一个属，国内外许多研究人员对此作了很多报道。经形态学、生理生化反应、生态特性和遗传型的鉴定，WQ.1归类为瘤胃球菌属(Rum inococcus)的黄色瘤胃球菌(Rum inococcus flavefaciens)。WH.2归类为丁酸弧菌属(utyrivibrio)的溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)。
2002年，崔宗均等从4种堆肥样品中分别筛选出纤维素分解能力较强的4组混合菌，再以酸碱反应互补的原则重新优化组合并驯化成组纤维素分解能力非常强而稳定的纤维素分解菌复合系MCl。同年，魏桃员等从造纸厂污泥中分离得到了一株能以纤维素为唯一碳源生长良好的纤维素降解菌w23，经鉴定，为假单胞杆菌。2005年，Souichiro Kato等构建了由五种细菌(梭菌属菌株CSKl，梭菌属菌株FG4，黄原酸假单胞菌属菌株M1.3，短芽孢菌属菌株M1和博尔德氏杆菌属菌株M1)组成的可降解纤维素的群落(命名为SF356)，该群落经20次继代培养它们仍能稳定共存，并且降解纤维素的能力增强了。
2006年，吴敏峰等采集健康奶牛的新鲜粪便。利用刚果红平板染色法分离筛选具有产纤维素酶活性的芽孢杆菌。并进行细菌菌落、形态和生化鉴定。结果从牛粪中分离出35株兼性厌氧的芽孢杆菌。利用刚果红鉴别培养基筛选出具有分解纤维素能力的菌株。并测定其水解圈大小。初步筛选出10株纤维素酶高产菌株，并对其进行了种属鉴定：一株为梭状芽孢杆菌，其余9株为芽孢杆菌属细菌。
2006年，伍时华等通过羧甲基纤维素琼脂平板、滤纸条培养基从自然环境中筛选到4株高效纤维素降解菌，其中木霉2株，青霉2株，分别记为T-1，T-2，P-1和P-2。2006年，朱军莉等从袋装降解的笋干中分离到一株分解纤维素的细菌菌株。该菌株呈长杆状，革兰氏染色为阳性，产芽孢，命名为BSX5。经鉴定，确定该菌株为枯草芽孢杆菌。
2007年，刘玉承等从日粮精粗比为3:7的小尾寒羊×蒙古羊杂交一代绵羊的瘤胃内容物中分离到2株严格厌氧细菌，一株球菌WQ.1.l株弧菌WH.2，二者对滤纸有很好的降解能力。通过酶活力试验测得WQ.1的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活和p2葡萄糖苷酶活分别为0.66 U/ml，7.0 U/ml和15.3 U/ml；WH.2的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活和D-葡萄糖酶活分别为0.52U/ml，6.9 U/ml和17.2 U/ml。
同年，韩绍印等从造纸厂废纸浆中分离到一株纤维素降解细菌CP4，在温度为20-50 ℃和PH为5-10的条件下，CP4能够快速生长并分泌纤维素酶。在35 ℃和PH为9的条件下，培养8 h后CP4开始产酶，培养3 d后相对酶活为5.43 mm/d，经初步鉴定，确定该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)。
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1.2.2 纤维素分解菌的选育
近年来，在纤维素分解菌研究领域，还有人通过对已发现纤维素分解菌进行诱变，来增加产酶微生物菌种资源，提高纤维素酶的产量，并取得了较大的进步[9]。木霉菌经化学、物理诱变后，其变异株产纤维素酶性能明显提高。Hideo等[10] 将0.10%秋水仙素处理35 d的里氏木霉(Trichoderma reese)RUTC230，用灭菌灵单倍体化，从单倍体克隆长成的分生孢子器中分离出高产纤维素酶菌株，随后分别用含有1%废纸粉的培养基作为选择培养基和含有1%的微晶纤维素的培养基作为二级选择培养基进行筛选。筛选出的WP.1菌株对羧甲基纤维素钠(CMC)、微晶纤维素和水杨苷活力分别是原始菌株的1.9，2.0和3.5倍。韩峰等[11]以拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)TH为出发菌株，采用紫外诱变获得一株抗高浓度葡萄糖阻遏突变株UVIII，纤维素酶产量显著提高。Prabavathy等[12]将里氏木霉制备成原生质体并融合，在CMC琼脂平板上再生，筛选了15个融合体，相对于原始菌株，在CMC平板上出现的透明圈更加明显，其中，有2株融合子SFTr2和SFTr3相对于原始菌株PTr2酶活提高了2倍多[13]。纤维分解细菌经离子束注入诱变，其突变菌株产纤维素酶活性也明显提高。曾宪贤(2005)等对纤维分解细菌HY2进行不同剂量离子束注入诱变，筛选出纤维素酶活性高的突变菌株HY2.3。通过聚合酶链式反应PCR技术扩增得到纤维素酶高产菌株芽孢杆菌(Bacillus sp)HY2.3以及原始菌株芽孢杆菌HY2的纤维酶基因chy2.3和chy2。经过克隆和序列分析表明，所得到的突变型和野生型纤维素酶基因编码区均为1500 bp，同时发现，经过离子束诱变得到的高产菌株和野生菌株的纤维素酶基因序列存在差别。这些碱基突变引起氨基酸序列的改变有可能导致两个菌株纤维素酶产量上的不同。
1.4 本文研究的目的与意义
本文主要从广西香蕉秸秆的土壤，武汉武丰宰牛厂牛的瘤胃，武汉晨鸣造纸厂
的污水排放口的污泥以及汉阳江边的土壤筛选出能够高效降解纤维素的菌株。并从形态学和生理生化等方面对筛得的菌株进行菌种鉴定。
高效纤维素降解菌在环境污染，堆肥，动物饲料等方面起到不可替代的作用。
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2 实验部分
2.1 材料
2.1.1 样品来源
微生物分离样品来自广西香蕉秸秆的土壤，武汉武丰宰牛厂牛的瘤胃，武汉晨鸣造纸厂的污水排放口的污泥以及汉阳江边的土壤。
2.2 主要试剂与仪器
2.2.1 主要试剂
本实验所用的主要试剂见表2.1.
表2.1 试剂 Table2.1 regents
药品名称
分子式
纯度或含量
AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR AR
生产厂家
天津市东丽区泰兰德化学试剂厂 天津市东丽区泰兰德化学试剂厂 天津市科密欧化学试剂有限公司 上海试一化学试剂有限公司 天津市天达净化材料精密化工厂 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市科密欧化学试剂有限公司 天津市科密欧化学试剂有限公司 天津市恒兴化学试剂制造有限公司 天津市化学试剂三厂 上海实验试剂有限公司 上海山浦化工有限公司
天津市天力化学试剂有限公司 湖南湘大化工试剂有限公司 上海国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 武汉鼎国生物技术有限公司
K2HPO4·3H2O 磷酸氢二钾
KH2P04 磷酸二氢钾
NaNO3 硝酸钠
MgSO4 硫酸镁
CaCl2 氯化钙
NaCl 氯化钠
KCl·H2O 氯化钾
CoCl2·6H2O 氯化钴
FeSO4·7H2O 硫酸亚铁
ZnSO4·7H2O 硫酸锌
MnSO4·H2O 硫酸锰
C6H11NaO7 羧甲基纤维素钠
C6H5Na3O7·2H2O 柠檬酸钠
C32H22N6Na2O6S2 刚果红
C6H8O7·H2O 柠檬酸
C6H8O7·H2O 3,5-二硝基水杨酸 琼脂
注：(1) AR: Analytical reagent 分析纯试剂
(2) 主要分子生物学试剂见具体实验方法部分
(1) DNS试剂：称取5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于蒸馏水中，加入10 g氢氧化钠，100 g
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酒石酸钾钠和250 ml水，加热溶解后再加入结晶酚1 g，无水亚硫酸钠0.5 g，待全部溶解后冷却，定容至500 ml，贮于棕色瓶中，放置一周后使用，使用前过滤。 (2) l %刚果红试剂：称取刚果红试剂l g于干净的小烧杯中，用量筒量取蒸馏水100 ml使之溶解，过滤，贮于棕色试剂瓶中。
(3) 0.2 M Na2HPO4溶液：取17.907 g Na2HPO4·12H2O加水溶解，定容至250 ml。 (4) 0.1 M柠檬酸：取5.2535 g柠檬酸加水溶解，定容至250 ml, pH 7.0。
(5) pH 4.4 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液：量取205.875 ml 0.2M Na2HP04和44.125 m1，0.1 M柠檬酸于250 ml烧杯中，调pH值，贮于试剂瓶中备用。
(6)1 %CMC溶液：取l g CMC粉末缓慢的加到l00 ml pH 4.4的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中，边加边搅拌，并用热水浴使其充分溶解，转于试剂瓶并放冰箱保存。
2.2.2 实验仪器
高压蒸汽灭菌锅、细菌培养箱、离心机、分光光度计、震荡培养箱、水浴锅、普通光学显微镜、数字显微图像处理系统、激光共聚焦显微镜、PCR仪、电泳仪、冰箱、超净工作台、电热炉、紫外诱变箱、微波炉、PH计、电子天平等。
2.3 培养基
(1) 羧甲基纤维素钠培养基I：CMC 20 g，NaCl 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO4
1.0 g，酵母浸出物5.0 g，蛋白胨10 g，水1000 ml，琼脂20 g，pH自然，121 ℃灭菌20 min。
(2) 羧甲基纤维素钠培养基II：CMC 20 g，Na2HPO4 2.5 g，KH2PO4 0.5 g，白胨2.5 g，酵母膏0.5 g，水1000 ml，琼脂20 g，pH自然，121 ℃灭菌20 min。
(3) 发酵培养基：CMC 20 g，Na2HPO4 2.5 g，KH2PO4 1.5 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏0.5 g，水1000 mL，pH自然，121 ℃灭菌20 min。
(4) 滤纸条培养基：试管中加入上述无机盐溶液5 ml，加1条瓦特曼滤纸（6cm×1cm）垂直立于试管中，并使一部分露出液面，加棉塞121 ℃ 30 min灭菌。
(5) 刚果红纤维素琼脂培养基：KH2PO4 0.5 g， MgSO4·7H2O 0.25 g，琼脂15 g，明胶2.0 g，CMC1.88 g，刚果红0.20 g，蒸馏水1000 ml，PH值自然。
(6) PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1000 ml，自然PH。 制法：马铃薯去皮后，切成小块，加水煮烂（煮沸20~30 min，能被玻璃棒戳破即可），用4层纱布过滤，再加糖和琼脂，加热融化后飞、再补足水分至1000 ml, 121 ℃下灭菌20 min。
(7) 察氏培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁(MgSO4·7H2O), 0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 ml。
(8) 改良马丁培养基：蛋白胨5.0 g，磷酸氢二钾1.0 g，酵母浸出粉2.0 g， 硫酸
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