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各种微生物生化试验方法原理
通常利用生化试验的方法，检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物，称为细菌的生化反应，常用于细菌的鉴别。 1、 糖类分解产物 （1）糖发酵试验（carbohydrate fermentation test）不同种类的细菌对糖的分解利用能力不同，一般以能否分解某种糖，是否产酸产气等现象来鉴别。例如大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖，产酸且产气；而伤寒杆菌只分解葡萄糖产酸不产气，且不分解乳糖。这是因为大肠杆菌分解葡萄糖等产生甲酸，经甲酸解氢酶的作用生成H2和CO2。而伤寒杆菌无此酶，故分解葡萄糖只产酸不产气。
（2）VP试验（Voges-Proskauer test）产气杆菌将分解葡萄糖产生的两分子丙酮酸脱羧，生成一分子乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中氧气氧化，生成二乙酰，二乙酰可与培养液中含胍基的化合物（如蛋白胨中的精氨酸）反应，生成红色的化合物，此为VP试验阳性。大肠杆菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇，故VP试验阴性。
（3）甲基红试验（methyl red test）大肠杆菌和产气杆菌均属G-短杆菌，且都能分解葡萄糖、乳糖产酸产气，二者不易区别。但两者所产生的酸类和总酸量不一：大肠杆菌可产生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，而产气杆菌只产生甲酸、乙醇及乙酰甲基甲醇。故大肠杆菌培养液PH在4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，为甲基红试验阳性；产气杆菌培养液PH在5.4以上，加入甲基红后呈桔黄色，为甲基红试验阴性。
（4）枸橼酸盐利用试验(citrate utilization test） 产气杆菌在以枸橼酸盐为唯一碳源的培养基上生长，分解枸橼酸盐产生CO2，并转变为碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，含溴麝香草酚蓝（BTB）指示剂的培养基由淡绿色变为深兰色，此为枸橼酸盐利用试验阳性。大肠杆菌不能利用枸橼酸盐，故在此培养基上不能生长，培养基仍为绿色。 2、蛋白质及氨基酸的分解产物
（1）硫化氢试验（hydrogen sulfide test） 有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸等）产生H2S，如遇醋酸铅或硫酸亚铁，能生成黑色的硫化物，为硫化氢试验阳性。本试验常用于区别肠道杆菌的种类。沙门氏菌属通常为阳性;大肠杆菌、产气杆菌、志贺氏菌为阴性。
（2）明胶液化试验（gelatin liguefaction test） 有些细菌具有明胶酶，能分解明胶使其失去凝固能力而液化。变形杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌、枯草杆菌等能液化明胶；大肠杆菌、沙门氏菌则不能。
（3）吲哚试验（indole test） 有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成无色吲哚，加入对-二甲基氨基苯甲醛，无色吲哚生成红色玫瑰吲哚，
为吲哚试验阳性。大肠杆菌、霍乱弧菌等吲哚试验阳性；产气杆菌、伤寒沙门氏菌为吲哚试验阴性。
吲哚 对二甲基氨基苯甲醛 玫瑰吲哚
细菌的生化反应是鉴别细菌的重要手段：其中吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、VP试验(V)和枸橼酸盐利用试验（C），简称为IMVIC试验，常用于大肠杆菌与产气杆菌的鉴别。典型的大肠杆菌的IMViC试验结果为“++--”，而产气杆菌是“--++”。 0票 票数
实验四、微生物的快速鉴定和自动化分析技术
如何使微生物学技术方法快速、准确、简易和自动化，一直是微生物学工作者研究的热点，尤其是临床医学方面，对微生物的快速准确鉴定，更是\时间就是生命\。近20多年来，随着微电子、计算机、分子生物学、物理、化学等先进技术向微生物学的渗透和多学科的交叉，这方面已取得了突破性进展，许多快速、准确、敏感、简易、自动化的方法技术，不仅在微生物鉴定中广为使用，而且在微生物学的其它方面也被采用，推动了微生物学的迅速发展。 一、微量多项试验鉴定系统
该系统的根本原理是根据微生物生理生化特征鉴定的结果，而进行的数码分类鉴定。这种技术也称为简易诊检技术，或数码分类鉴定法。它是针对微生物的生理生化特征，配制各种培养基、反应底物、试剂等，分别微量（约0.1ml）加入各个分隔室中（或用小圆纸片吸收），冷冻干燥脱水或不干燥脱水，各分隔室在同一塑料条或板上构成检测卡。试验时加入待检测的某一种菌液，培养2~48小时，观察鉴定卡上各项反应，按判定表判定试验结果，用此结果编码，查检索表(根据数码分类鉴定的原理编制成)，得到鉴定结果，或将编码输入计算机，用根据数码分类鉴定原理编制的软件鉴定，打印出结果。
微量多项试验鉴定系统已广泛用于动、植物检疫、临床检验、食品卫生、药品检查、环境监测、发酵控制、生态研究等方面，尤其是临床检验中深受欢迎，迅猛发展。国际上此技术的产品，或称系统，种类繁多，国内有河南开封医学生物研究所的肠杆菌科细菌鉴定卡E-15；上海市卫生防疫站的发酵性革兰氏阴性杆菌鉴定系统SWF-A；中国人民解放军一八一医院的厌氧菌快速生化鉴定系列ARB-ID；深圳华士达生物科技有限公司的肠杆菌科的细菌生化鉴定卡ENT等。国外的产品已标准化、系统化和商品化，主要有法国生物-梅里埃集团的API/ATB；瑞士罗氏公司的Micro-ID，Enterotube,Minitek；美国的Biolog全自动和手动细菌鉴定系统：日本的微孔滤膜块等，其中API/ATB包括众多的鉴定系统，共计有750种反应，可鉴定几乎所有常见的细菌。微量多项鉴测技术优点突出，不仅能快速、敏感、准确、重复性好地鉴检微生物，而且简易，节省人力、物力、时间和空间，缺点是各系统差异较大，有的价格贵，有的个别反应不准，难判定，但毫无疑问，它是微生物技术方法向快速、简易和自动化发展的重要方向之一。
API20E系统是API/ATB中最早和最重要的产品，也是国际上应用最多的系统。该系统的鉴定卡是一块有20个分隔室的塑料条，分隔室由相连通的小管和小环组成，各小管中含不同的脱水培养基、试剂，或底物等，每一分隔室可进行一种生化反应，个别的分隔室可进行两种反应，主要用来鉴定肠杆菌科细菌，如图1所示。
图1 API 20E鉴定卡示意图
鉴定未知细菌的主要过程：将菌液加入每一个分隔室；培养后，有的分隔室的小杯中需要添加试剂，观察鉴定卡上20个分隔室中的反应变色情况，根据反应判定表（表1），判定各项反应是阳性还是阴性反应；按鉴定卡上反应项目从左到右的顺序，每三个反应项目编为一组，共编为七组，每组中每个反应项目定为一个数值，依次是1、2、4，各组中试验结果判定的反应是阳性者记\＋\，则写下其所定的数值，反应阴性者记\－\，则写为0，每组中的数值相加，便是该组的编码数，这样便形成了7位数字的编码，表2为举例说明；用7位数字的编码查API20E系统的检索表，或输入计算机检索，则能将检验的细菌鉴定出是
什么菌种或生物型。
表1 API20E反应判定表
鉴定卡上的反应项目 反 应 结 果 代 号 项 目 名 称 阴 性 阳 性 ONPN β-半乳糖苷酶 无色 黄 ADH 精氨酸水解 黄绿 红，橘红 LDC 赖氨酸脱羧 黄绿 红，橘红 ODC 鸟氨酸脱羧 黄绿 红，橘红 CIT 枸椽酸盐利用 黄绿 绿蓝 H2S URE 黑色沉淀 红紫 红紫 红 红 产H2S 无色 尿素酶 黄 TDA 色胺酸脱氨酶 黄 IND VP GEL 吲哚形成 黄绿 V.P.试验 无色 蛋白酶 黑粒 黑液 黄绿 黄绿 GLU 葡萄糖产酸 蓝 MAN 甘露醇产酸 蓝 INO 肌醇产酸 蓝 黄绿 黄绿 黄绿 黄绿 黄绿 黄绿 黄绿 SOR 山梨醇产酸 蓝 RHA 鼠李糖产酸 蓝 SAC 蔗糖产酸 蓝 MEL 密二糖产酸 蓝 AMY 淀粉产酸 蓝 ARA 阿拉伯糖产酸 蓝 表2 API20E举例说明
项目名ONPG ADH LDC ODC CIT H 2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR ARRHA SAC MEL AMY 称 A 所定数值 试验结果 记下数值 编 码 检索结果 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 + - + + + - - - - + - + + + + + + + + + 1 0 4 1 2 0 0 0 0 1 0 4 1 2 4 1 2 4 1 2 5 3 0 5 7 7 3 5305773 产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）
实验五、抗微生物药物敏感性试验
一、实验目的
抗微生物药物敏感性试验（药敏试验）的主要目的检出细菌的耐药性，预测抗微生物药物的临床治疗效果，并为临床医生针对某一特定的临床感染选用药物提供依据。对所有临床分离的可疑致病菌，如不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。 纸片扩散法 二、实验原理