发布时间 : 星期五 文章新一代DNA测序技术总览更新完毕开始阅读28eb8fbd1a37f111f1855b8e
图5. 纳米孔DNA测序以电子测量和光学阅读为检测方式。A. 在电子纳米孔方案中，通过离子电流，隧道电流和测量电压差而获得信号。每一种方法都必须产生特征性的信号以鉴别四种DNA碱基。B. 在光学阅读纳米孔的设计中，每个核苷酸被转换为一个预设的寡核苷酸序列和经标记了的标志物杂交，在DNA片段进行位移穿过纳米孔时被检测到。
John Kasianowicz及其同事使用离子流阻断方法，第一次展示了多聚核苷酸(poly[U])穿过生物分子纳米孔而位移的过程。这种纳米孔是以悬浮在磷脂双分子层中的葡萄球菌α溶血素做成。作者推断，只要满足下面条件，单个核苷酸就能被区分：（1）每个核苷酸产生自己唯一的信号签名；（2）纳米孔的缝隙有合适的几何结构，每次只容纳单个碱基；（3）电流检测有足够的分辨率去探测核苷酸位移速率；（4）当电势起作用时，核苷酸片段应该是单向运动的；（5）纳米孔和支撑膜之间的组装应该足够牢固。所有的生物和合成纳米孔都有厚度为5nm的桶状结构通道（比碱基到碱基的距离3.4?长得多），每次可以容纳10~15个核苷酸。这样，利用阻断电流检测就不可能获得单个碱基分辨。另外，聚合物通过纳米孔的平均速度约为1核苷酸/微秒，这样的速度快得无法处理。核苷酸链位移应该被控制成在120-150 mV电势下慢至1核苷酸/毫秒，这样就可得到微微安培（pA）级的电流信号。此外，任何两个聚合物单链的位移事件应该是均一的。两个位移过程（捕获、进入和位移）的时间分布不是泊松分布，并且常常可能存在着一个数量级的差别。这就意味着，如果两个分子以相差很大的速率穿过同一个纳米孔时，慢的那个可能会被漏掉或错误解读。Andre Marziali等以原子力显微技术通过单分子结合特性去研究这些事件。DNA通过α溶血素蛋白纳米孔时所显现出的非均一动力学，归因于DNA与纳米孔蛋白氨基酸残基间存在着弱相互作用。
由于离子电流检测的一些困难（离子流通过纳米孔产生的电流），研究者也关注一些其他的检测方案，如：隧道电流的检测和电容变化的检测。在横向面隧道电流方案中，电极被置放在纳米孔的开口上，信号由亚纳米探针检测。在电容检测方案中，则是探测跨越金属氧化物-硅的层状结构的电压。当带电核苷酸纵向通过电容器时，会由于诱导而产生电压信号。典型的对核苷酸的光学识别包括两个步骤。第一步，目标序列的每个碱基被转换为一段序列的寡核苷酸，然后该寡核
苷酸与两色的分子信标（附带着荧光基团）进行杂交。由于必须确定四种核苷酸，两个荧光探针要成对地耦合去确定每个核苷酸。例如，如果A和B两个探针，其四个独特的排列将是AA，AB，BA，和BB。当杂交了的DNA链通过纳米孔时，荧光标签从其配对链（测序的目标序列）上被剥离下来，随即荧光信号就能被检测到。蛋白纳米孔和固态纳米孔都可以用于这种方法。电子检测方案和光学读出方法的细节在以前发表的论文都已有详尽的阐述。
Daniel Branton及其同事在2008年的一篇综述中讨论了纳米孔测序的发展和在高通量测序中低成本样品制备的前景。他们估计使用商业化试剂盒抽提和纯化来自血液的基因组的成本低至每个样品40美元，纯化后的基因组DNA足够测序使用（108个拷贝或者700微克）。所有现存的测序技术都需要将DNA打断成100左右碱基对长度的片段，然后进行多重测序以寻找重叠区域，从而可以组装在一起。纳米孔测序最吸引人的优势之一是能实现较长的读长，这样基因组组装过程将大大简化。在未来的实践中，其测序读长可能会只因为样品制备过程中DNA被吹打剪断而受到限制。例如，Meller和Branton显示25 千碱基的单链DNA可以线性通过生物纳米孔，而5.4 千碱基的的单链DNA可以通过固态纳米孔。另外有多个研究小组也证实，小寡核苷酸、原始的单链DNA、双链DNA都可以以很高通量位移通过纳米孔。
蛋白纳米孔测序法牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore technologies，以前的Oxford Nanolabs），已经解决一部分上述的技术难题，并将纳米孔技术的引入了其商业化产品（GridION系统）。由牛津大学教授Hagan Bayley创办的牛津纳米（Oxford Nanopore），旨在将他实验室的生物纳米孔研究成果进行商业化。该公司正与哈佛大学的Daniel Branton, George Church, Jene Golovchenko，加州大学圣克鲁兹分校的David Deamer、Mark Akeson，美国国家标准技术研究所的John Kasianowicz展开合作。
牛津纳米孔技术公司的首席执行官Gordon Sanghera最近宣布，该公司正准备推出可用于直接单分子分析的GridION系统，该系统将采用外切酶测序。该系统基于\芯片上的实验室\技术，将多个电子元件整合进一个支架状的装置。一个蛋白纳米孔整合进磷脂双分子层，位于微池顶部，并配有电极。许多微池被整合入一个阵列芯片，每个模块控制一个芯片，整合包括用于样品制备、检测和分析的液体流动和电子系统。样品被引入模块，这个模块插入一个叫GridION节点的装置。每个节点可以单独使用也可以成簇使用，所有节点间可以实时互相沟通、可以同用户的网络系统和存储系统进行沟通。虽然该平台的主要用于DNA测序，但它也可以进行调整（对α溶血素蛋白纳米孔进行适当调整）而用于蛋白质和小分子的检测。
牛津纳米孔技术的第一代系统使用的是α溶血素蛋白七聚体。α溶血素蛋白提供了低成本、稳定的生物纳米孔。牛津纳米孔技术正在对两种类型的测序方法进行商业化：核酸外切酶测序和链测序。在核酸外切酶方法中，环糊精接头分子位于蛋白纳米孔的里部，作为DNA结合位点。此外，纳米孔还偶联了一个核酸外切酶分子，该酶分子可以从DNA链上逐个剪切单个碱基，这样，纳米孔就可以在DNA碱基通过并与环糊精结合时精确地检测出每个碱基。外切酶位于纳米孔的
顶部，控制DNA链的位移速度，使其由固有的泳动速度（微秒级）降低下来（毫秒级）。最必要的是，每个核苷酸通过纳米孔大致时间是20 毫秒，这个速度足以用于精确检测。四种核苷酸产生不同程度的电流阻断，因此，DNA序列的测定是可能的。假设以稳定的速度每毫秒测一个碱基，单独的一个纳米孔需要69天去处理60亿个碱基。从理论上而言，100000个孔以此速度测序，只需要30分钟就能得到30倍覆盖度的基因组数据。
图6. 牛津纳米公司所采用的生物纳米孔方案图。A. 溶血素蛋白突变体图略，图中描述了环糊精（在第135残基处）和谷氨酰胺（在第139残基处）的位置. B. 突变的纳米孔的桶状结构的详图。显示了精氨酸（在第113残基处）和半胱氨酸的位置. C. 外切酶测序法：外切酶分子附着到纳米孔的顶部，将目标DNA链上的单个核苷酸逐一切下来，再使它们通过纳米孔。 D. 残基电流-vs-时间的信号轨迹，能将四种不同的碱基清楚的区分开来。 E. 链测序法：单链DNA线性通过一个蛋白纳米孔，单个碱基得以区分开，而DNA链保持完整。
牛津纳米孔技术也正致力于链测序技术，即当单链DNA片段通过纳米孔时检测每个碱基。这个方法可能比核酸外切酶测序方法更快更准确。因为所有的核苷酸都是相互连接的，所以可以避免读错方向。不过，真正的挑战在于，当它们通过纳米孔时，如何精确地读取每个单个碱基。
固态纳米孔测序法虽然α溶血素七聚体相当不错，但用于悬浮纳米孔的磷脂双分子层并不稳定且难以操控。固体或是人造纳米孔被认为是下一代纳米孔技术，一方面因为它们无需使用有机材料做支撑物，而主要是它们更加稳定。固态纳米孔还能在单个设备上平行地多重使用，这是生物纳米孔无法达到的。人造纳米孔组装在固态物质上，如氮化硅，硅或金属氧化物，及最近使用的石墨烯。石墨烯是一种新的单原子厚度的材料，是所知的最薄的膜。宾夕法尼亚大学的Marija Drndic小组发表了DNA通过石墨烯膜纳米孔的检测实验，该膜的厚度为1 - 5纳米，纳米孔的直径为5 - 10纳米（图7A）。在其他出版物中，哈佛大学
Golovchenko实验室的研究人员发现，石墨烯薄片可以作为膜材料支持固态纳米孔和把离子溶液分隔为两部分（图7B）。
目前IBM与454 生命科学（罗氏）联合开发一种新型固态材料的人造纳米孔（是金属介质的层状结构）DNA测序新方法。这个想法来源于2006年得系统生物学家Gustavo Stolovitzky和IBM电气工程师Stanislav Polonsky。由电子束在10nm厚的氮化钛膜上钻得3纳米的人工纳米孔，然后用二氧化硅绝缘层将其分开。
图7. 几种合成的纳米孔测序装置的设计图。A. 此装置是后1-5纳米的石墨烯，它被悬置于一张硅片上，硅片则以5微米厚的二氧化硅层进行包被. 该装置被安装在一个PDMS芯片中，芯片两侧有流体通道. B. 在石墨烯薄膜上钻的纳米孔。该纳米孔悬置于碳化硅片层上，并跨越由硅做成的支架。石墨烯薄膜将两种溶液分隔开，有银和氯化银电极连着两极。 C. IBM公司的DNA半导体装置示意图. 以电子束钻得的纳米大小的孔。在两侧的开口处加上电场，就可以进行电荷捕获。 D. 对通过的DNA片段进行电子阅读的固态纳米孔。6聚合体的寡核苷酸探针和单链DNA片段杂交后正通过纳米孔。电流-vs-时间的信号轨迹线被记录下来。 当DNA链被牵引通过纳米孔时，横跨金属层的电场翻转（也称为棘轮效应），产生固定作用，可控制DNA链的运动。电场的交替可能有利于提高测序准确性。有两种检测信号的方法，测量电容或离子电流（类似于牛津纳米孔检测，但在这里，DNA链将保持完整）。为了获得足够强的信号，DNA链会被捕获住，以经受为时一毫秒的审问。尽管预计他们仍需要5至7年的发展才会推向市场，但其电子检测方式加上方便的样品制备，使其在廉价测序领域极具潜力。
尽管通过阻断电流测定穿过人工纳米孔获得单碱基分辨率是一种挑战，但是很多团队能够在宽度足够容纳双链的纳米孔中轻易地区分单链DNA和双链DNA的位移。因为容易得到的粗分辨率，研究者通过将杂交探针附加到DNA片段上，开