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毕业论文文献综述
生物工程
多酚氧化酶活性测定及控制
1 前言
多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。本文总结了多酚氧化酶的活性测定方法以及对其活性的控制，主要研究了抑制剂对其活性的影响，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。
多酚氧化酶（PPO）作为一种植物酶类，是引起果蔬褐变的主要因素。鲜切果蔬因组织被切分使PPO与酚类底物的接触机会增加，酚类物质被氧化成棕褐色的醌，导致产品褐变。抑制PPO活性取决于抑制剂的性质和浓度、底物的可利用性、pH值和温度。一些还原剂、酶类、螯合剂和蜂蜜等均已被用于防止果蔬酶褐变。本文主要总结了抑制剂对于控制果蔬PPO活性的研究。 2 主题部分
2.1 从果蔬中提取PPO（以莲藕为例）
2.1.1 丙酮法（丙酮法提取所得酶液比活力最高。适合需大量制样时使用）
将莲藕洗净，去皮，切碎，加4倍量预冷至．18。C的丙酮(w／v为1：4)捣碎，搅拌3min，抽滤，冷风吹干残渣后，混匀，得丙酮粉。称取丙酮粉O．5 g，加入0．2 mol／L，pH为5．4的预冷磷酸二氢钠．柠檬酸缓冲液20ml，搅拌3min，8 000r／min离心10min，所得上层清液即为粗酶液。
【1】
2.1.2 匀浆法（匀浆法提取的酶液没有活性）
将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，抽滤。向滤渣中加入0．05mol／L，pH5．4磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液(W／V为1：1)再次搅拌，抽滤，两次滤液合并，8 000r／min离心10rain，所得上清液即为粗酶液。
【2】
2.2.3 匀浆浸提法（匀浆浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作简便，提取所得粗酶液活性
高，且可以直接用于研究）
（1） 将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，4。C下静置4h，抽滤，所得滤液即为粗酶液。3
（2） 每个处理准确称取莲藕20．0 g，切碎后加入50．0 mL磷酸缓冲溶液(pH6．5)冰浴研磨后，低温下离心5 mill(3000 r／rain)，取上清液得粗酶液。4
（3）新鲜藕肉去皮打浆后，采用pH值为5．4的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液(含5％PVPP和10％NaCl)提取，料液比为l：2．2，置4℃冰箱中浸提4h，提取的莲藕PPO活性最大。5 2.2 PPO的分离纯化
取10℃下贮藏到第8天的鲜切莲藕片组织250 g，首先采用液氮速冻，按1：2质量比例加入经过预冷(4℃)的0．1 mol／L、pH6．8的磷酸缓冲液(内含5 oA的PVP)，在高速组织捣碎机上捣碎，然后于4℃下浸提2 h，用4层脱脂纱布过滤，滤液于10 000 r／min、4℃下离心15rain，上清液即为多酚氧化酶粗酶液。向粗酶液中边搅拌边加入固体硫酸铵至30％饱和度，4℃下静置2 h，于10 000 r／rain、4℃下离心10 min，弃沉淀，继续向上清液中加入硫酸铵至70％饱和度，4℃下静置过夜，然后于10 000 r／min、4℃下离心15 min，弃上清液，将沉淀用尽量少的0．1 mol／L、pH值为6．8的磷酸缓冲液溶解，得到酶的提取液。然后将酶提取液用0．1 mol／L、pH 6．8的磷酸缓冲液透析过夜，中间换透析液2次，然后用amicon超滤杯浓缩至10 mL。6
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2.3 PPO活性的测定
2.3.1消光值法测定PPO活性
在l cm比色皿中，加入1．5 mL pH7．0的磷酸盐缓冲溶液，再加入O．1 mol／L邻苯二酚溶液1．0mL，迅速加入PPO粗酶液0．5mL，混匀。在420nm波长处测吸光度，每10 s记录1次吸光度(0／)420)随时间的变化值。最后确定30 s和l min时检测，在室温下测定PPO的活性(27℃)，测定OD420值。以最初直线段的斜率(△OD／t，卜时间，min)计算酶 活力。一个相对酶活性单位定义为：该酶液在测定条件下每分钟引起吸光度值改变0．001所需的酶量。PPO相对活性=各处理组吸光度值／同组最佳处理组吸光度值×100％。7
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2.4 抑制剂对PPO活性的控制
2.4.1 核桃组织培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制
将硫代硫酸钠(Na2S2O3)、硝酸银(AgNO3)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为抗氧化剂来防止核桃组培褐变,分别将其设定为X1、X2、X3。按照三元二次回归组合设计,得到数学模型来达到精确控制褐变的目的,并且为核桃组织培养过程中如何控制褐变提供理论依据。结果显示：在抑制PPO活性方面,PVP作用最明显,其次是Na2S2O3、AgNO3。10
2.4.2纯化的莲藕多酚氧化酶(PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化
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园二色谱分析表明莲藕PPo主要含有α一螺旋和β一折叠结构。与抑制剂作用后，莲藕PPO活性显著降低，同时伴随其二级结构中α-螺旋结构明显减少，表明莲藕PPO的活性中心可能位于α-螺旋结构中。荧光分析表明，莲藕PPO与邻苯三酚(pyrogallic acid，PA)作用后，酪氨酸残基荧光强度略有降低，入max位移不明显，色氨酸残基荧光强度略有降低，入max红移2 nm；而与莲藕多酚(Lotus root polyphenol，LRP)作用后，莲藕PPO分子中酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)残基荧光强度显著提高，且其最大发射波长分别蓝移6nm和红移5nm。当加入异Vc钠后，Tyr和Trp残基最大发射峰显著红移，说明Trp和防残基位于一定的疏水环境对维持PPO催化活性的优势构象至关重要。11
2.4.3 磁场对莲藕多酚氧化酶反应动力学的影响
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以邻苯二酚为底物,莲藕PPO褐变反应动力学符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动力学,Km为0.775mol/L,Vmax为11.150U/min。Vc对PPO有较强的抑制作用,反应动力学参数Km为0.081mol/L,Vmax为3.243U/min,呈现反竞争性抑制,表现为褐变出现滞后,随Vc浓度的增大滞后时间逐渐增长,且呈现S型趋势,并建立了相应的反应方程。不同磁场强度下,随着处理时间的变化,PPO活性呈现波动性。3.17A/m磁场强度下处理4h的酶液其反应动力学曲线表现为S型,并建立了相应的反应方程。12
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2.4.4 南湖菱果中多酚氧化酶抑制剂对其活性的影响
南湖菱PPO催化反应的最适温度为30 0C ,最适pH 6.5 ,最佳吸收波长420 nm ,最大反应速度Vmax=33.67 unit/min，米氏常数Km= 0.286 mol/L。在3种抑制剂抗坏血酸、EDTA和柠檬酸中，抗坏血酸的抑制效果最好，最佳浓度为0.3 mmol/L。13
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2.4.6 二氧化氯(ClO2)对鲜切莲藕在低温贮藏期间多酚氧化酶(PPO)的影响
ClO2具有消毒、杀菌、防腐、漂白、除臭等多种功效，是世界卫生组织(WHO)和世界粮农组织(FAO)向全世界推荐的A1级广谱、高效、安全化学消毒剂。14用100mg／L浓度的ClO2处理鲜切藕片5min、10 min、15 min后，在贮藏期间能抑制PPO的活性，而10 mg／L浓度对PPO的活性不起抑制作用反而促进了PPO的活性．100 mg／L ClO2处理鲜切藕片10 min抑制PPO的活性效果最好。15
2.4.7 底物浓度、pH、温度对鲜切莲藕中PPO酶的影响
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鲜切莲藕的PPO活性最适反应底物浓度为0.02 mol/L，并且底物浓度与PPO活性的关系完全遵循Michealis-Menten的酶促动力学性质。PPO最适pH值为7.O，pH对PPO的影响显著，当pH<4.0时，PPO活性显著下降，可见，调节pH值可有效地抑制PPO活力。PPO活性的最适温度为35℃，在0℃-5℃之间，莲藕的PPO活性受到明显的抑制。16
2.4.8 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响
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添加抑制剂可使莲藕PPO反应速率发生变化。苯甲酸I可与酶E结合生成无活性的二元复合物EI，减小可供邻苯二酚进攻的游离酶E的浓度，也就降低了酶一底物ES的浓度，而且再增加底物浓度，反应速率都不可能达到无抑制剂时的最大速率ymax，从而破坏了莲藕PPO的正常催化氧化反应系统
【12】
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2.4.9护色处理对多酚氧化酶活性的影响
对鲜切莲藕褐变抑制的最佳囚子组合为EDTA浓度为0.25% , Vc浓度为0.1%、草酸浓度为0.25%半胱氨酸浓度为0.7%、处理时间为8min。17采用0．15％柠檬酸+0．05％D异抗坏血酸钠+1．0％氯化钠作组合护色液护色40min可以起到很好的抑制莲藕的酶促褐变的作用。18
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3 展望
莲藕中酚类物质的氧化与其褐变程度密切相关，但莲藕中主要酚类物质的种类和在褐变中的主要作用，以及与PPO的作用方式等都有待于进一步研究。目前对莲藕色素前体物质的报道较少，因此深入分析莲藕中酚类物质的组成、结构、性质，从而阐明其与莲藕贮藏保鲜和加工质量的关系，
具有重要的理论意义和实用价值。
参考文献
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