发布时间 : 星期三 文章自译 QIAGEN Plasmid Mini Kit更新完毕开始阅读06877133effdc8d376eeaeaad1f34693daef10f9
中文版QIAGEN Plasmid Mini Kit
使用前注意事项：
1． Buffer P1在使用前加RNase A solution（RNA酶溶液），一瓶Buffer P1加入一小瓶RNase A（用前瞬时离心），终浓度为100ug/ml。
2．检测Buffer P2是否有因低温储存而引起的SDS沉淀。如有必要，将SDS在37℃溶解。 3．Buffer P3在4℃下预冷。
4．选择性操作：把提供的LyseBlue reagent（LyseBlue试剂）加入到 Buffer P1并在用前混匀。一瓶Buffer P1加一小瓶LyseBlue（用前瞬时离心），这样LyseBlue被稀释1000倍。LyseBlue提供视觉识别的最佳缓冲混合从而防止共同处理错误导致低效细胞溶菌作用和不完整的SDS沉淀,基因组DNA,细胞碎片。 步骤：
1.从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到2-5mL含有适当抗生素的LB液体培养基中生长。将液体培养基置于37℃，300rpm的摇床中振荡8小时。 使用瓶或容器的体积至少4倍体积培养。
2.用LB培养基以1/500-1/1000的比例稀释含菌落的培养基。让其在37℃，300rpm的摇床中振荡12-16小时（300rpm）。
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使用瓶或容器的体积至少4倍体积培养。培养应该达到细胞密度约为3 - 4 x 10 细胞每毫升,也即是每毫升的细胞干重3g左右。 3. 4℃离心机6000×g离心15min收集细菌细胞。
（如果想在此步骤停止以后再做，把细胞-20℃冻存。） 4．0.3mlBuffer P1重悬细菌细胞。
（确保Bufer P1里已经加入RNase A。
如果Buffer P1里已经加入LyseBlue reagent，为确保LyseBlue颗粒完全重悬使用前大力摇一下Buffer瓶子。为使细菌完全重悬，可以斡旋或者用胶吸管来回上下打散细胞直到没有细胞团留下为止。） 5．加入0.3ml Buffer P2，上下颠倒封盖的管子4-6次彻底混合溶液，室温（15-25℃）下放置5min。 （不要vortex，因为vortex能导致基因组DNA被剪断。裂解液会有粘性。溶解反应不要超过5min。装有Buffer P2的瓶子用后要立即盖紧，以免被空气中的CO2酸化。如果Buffer P1里加有LyseBlue，那么在加入Buffer P2后细胞悬浮液会呈现蓝色。混匀后悬浮液的颜色会很均一。如果悬浮液仍有无颜色区或者褐色细胞团存在，请继续混合直到颜色均一为止。） 在孵育过程中准备QIAfilter Cartridge:
把盖子拧到QIAfilter Midi 或 QIAfilter Maxi Cartridge的下出口处.然后放置到你方便使用的地方。 6．加0.3ml预冷的Buffer P3，立即上下颠倒4-6次混匀，冰上孵育5min。 （预冷的Buffer P3和冰上放置能促进沉淀。加入Buffer P3后有乳白色的物质形成且裂解液粘性度减少。沉淀物中含有基因组DNA、蛋白质、细胞残渣和KDS。为保证十二烷基磷酸钾沉淀，裂解液要充分混合。若混合液依旧粘稠，请继续混合彻底中和溶液。如果使用了LyseBlue试剂悬浮液，则需要混匀至蓝色彻底消失呈现无色。悬浮液均匀无色表明SDS已完全沉淀。） 7. 离心机在最大转速离心10分钟。迅速转移含有质粒DNA的上清。
（在离心前需将样品再次混匀，离心速度应在1.5ml或者2ml离心管离心机最高转速（10000-13000rpm），大多数离心机对应速度为14000-18000×g。离心后上清应无杂质。如果上清依然存在杂质，应再次短暂离心，避免任何杂质影响柱子。）
取50ul样品保存以备跑分析胶确定生长和裂解状态是否最佳。 8．用1mlBufer QBT平衡QIAGEN-tip 20以使柱子因重力流空。 将QIAGEN-tips放置在QIArack或管架上。
（因为平衡液中有洗涤剂存在，buffer将因为表面张力自动开始流动。让QIAGEN-tip彻底排空。因为当弯液面到达柱子的上胶面时buffer流会停止，所以QIAGEN-tip可以无人看着。） 9.将步骤7的上清转移至QIAGEN-tip 20 然后让其通过重力流进入QIAGEN-tip树脂。 上清应及时转移至QIAGEN-tip，如果放置太久沉淀飘起应再次离心防止堵塞QIAGEN-tip。
取样50ul样品保存以备跑分析胶确定DNA结合QIAGEN 树脂的效率。 10．用2×2ml（2×2ml）Buffer QC(wash buffer)洗QIAGEN-tip。 Buffer QC通过重力流通过QIAGEN-tip。 取出220ul样品保存以备跑分析胶。
11．用0.8mlBuffer QF(elustion buffer)洗涤DNA。
（把洗出液收集到一个1.5ml-2ml的管子里（管子自备）。
注：对于大于45-50kb的产物，把elution buffer在65℃预热可能会有助于增高产量。 取45ul洗出液保存以备跑分析胶。 12．向DNA洗提液里加入0.7体积（0.56ml每0.8ml）的室温异丙醇沉淀DNA。混匀立即在≧15000×g rpm 4℃离心30min。小心转移上清液至另一瓶子。
（所有溶液还要放室温以减少盐类沉淀。因为异丙醇颗粒是玻璃表面，所以可能会比从酒精沉淀产生的柔软的含盐颗粒更难看到。离心前在管的外面坐标记便于小粒的定位。异丙醇小粒在管壁上结合得较松，所以在转移上清液是要非常小心。）
13．用1ml 70%室温保存的乙醇洗涤DNA颗粒，在≧15000×g 4℃离心10min。小心转移上清液至另一瓶子，不要激荡DNA颗粒。
（70%乙醇可以移去沉淀的盐并用更易挥发的乙醇替换异丙醇，这样更易于DNA的再溶解。）
14．空气干燥5-10min，用适当体积的buffer溶解DNA。(TE buffer ，pH8.0 或者10mMTris-cl，pH8.5) （润洗管壁再溶解DNA颗粒。应该避免上下吹打DNA，因为那样会促进DNA的重悬可能还会切断DNA。颗粒过于干燥会使DNA难于溶解。DNA在微碱性条件下会溶解的更好，而在酸性溶液中不容易溶解。）