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鱼类分子系统学研究
摘要：鱼类的进化地位非常重要，鱼类是最低等的脊椎动物,是无脊椎动物向脊椎动物进化的重要一环。鱼类系统进化的方法有分子系统学的方法及形态学的方法，本文介绍了分子系统学的相关研究，根据多年来的研究详细介绍与总结了主要的分子系统学研究方法，包括基于线粒体全基因组的系统进化，基于细胞色素b片段序列分析系统进化的方法，短散在核重复序列SINEs在鱼类系统进化的研究及鱼类微卫星标记的应用等，并对分子系统学在鱼类系统进化中的作用及前途做了展望。
关键字：鱼类；分子系统学；线粒体全基因组；细胞色素b；SINEs；微卫星； 前言
现代鱼类生活在地球上的各种类型的水域中，是现存数量最多、动物进化研究中最重要的脊椎动物。它们是数量最多的脊椎动物，其次颌的产生是脊椎动物发生巨大的变化，到末期，鱼类的登陆更为脊椎动物的进化开创了许多新的可能性。尽管如此，这也只是鱼类突出的一部分。从整个鱼类进化的系统树上来看，仅仅是很小的分支，也是适应现代生活环境最成功的类群。在大约五亿年前的寒武纪晚期的地层中，就发现了鱼类化石。
系统发育（phylogeny）也称系统发展，是与个体发育相对而言的，它是指某一个类群的形成和发展过程。大类群有大类群的发展史，小类群有小类群的发展史，从大的方面看，如果研究整个植物界的发生与发展，便称之为植物界的系统发育。
系统发育学研究的是进化关系，系统发育分析就是要推断或者评估这些进化关系。通过系统发育分析所推断出来的进化关系一般用分枝图表（进化树）来描述，这个进化树就描述了同一谱系的进化关系，包括了分子进化（基因树）、物种进化以及分子进化和物种进化的综合。
1分子系统学（molecular systematics）概述 1.1分子系统学定义及原理
分子系统学[1]是新近发展的一门综合性前沿学科，它以分子生物学、系统学、遗传学、分类学和进化论为理论基础，以分子生物学、生物化学和仪器分析技术的最新发展为研究手段，具有很强的交叉性。分子系统学主要包括了两大领域：即种群遗传学（population genetics）和系统发生学（phylogenetics）[2]。
生物大分子包含了海量的遗传信息，它们是分类、系统发育和进化的内在决定因素，分
子生物学恰是通过对其定量描述和分析，在分子水平上解释生物的多样性、系统发育及进化规律，并对演化机制的本质进行探讨。其遵循的基本原理主要有：（1）生物大分子的进化恒定性原理；（2）生命的生化一致性和多样性原理；（3）表信息分子（次生代谢物质）的计划原理。同源比较原理和样品同质性原理则是其方法论基础[3]。 1.2 发展条件
分子系统学的发展主要依靠[4]：1、分子实验方法的不断改进；2、基因组全序列的测定；3、用于研究的基因种类不断增加，对这些基因的结构、功能、进化规律认识的不断深入；4、化石 DNA 的研究；5、分析软件包的不断完善及计算机运算能力的增强。 1.3 分子系统树
在近现代的生物研究领域，分子生物学的地位日益重要，由于各种先进学科（遗传学、进化论、分类学、概率统计、计算机科学和群论等）的交叉与帮助，分子系统学以及生物信息学等一系列新兴边缘学科为解决某些长期困扰生物学家的问题开辟了一条全新的绿色通道。1987 年美国冷泉港国际定量生物学会议特辟出“进化树”专栏，标志着这一领域成为现代生物学的前沿之一。科研人员通过现代分子生物技术逐层解开了生命的密码，简单的 C、T、A、G 序列编译了生物大分子携带的各种信息，使用生物软件对选定区域的碱基序列进行信息读取、比较、分析后，以直观的拓扑结构表示所研究物种内在遗传进化关系的图谱便被形象地称为分子系统树。
分子系统树或者叫做分子进化树，不仅能够精确地反映物种间或群体间在进化过程中发生的极微细的遗传变异（一个氨基酸甚至一个核苷酸的差异），而且借助化石提供的大分子类群分化年代信息，可以定量地估计出物种间或群体间的异化年代，这对进化论的研究而言无疑是一场革命[5]。 1.4系统树的构建方法
利用分子生物学数据构建系统发生树的方法很多。目前较常用的主要有两大类，即距离矩阵法 （Distanee Matrix method）和具体性状法，后者又主要包括三种：最大简约法（Maximum Parsimony method，MP），最大似然法（Maximum Likelihoodmethod，ML）和贝叶斯推断法（Bayesian Inference）。 2分子系统研究的常用遗传标记 2.1基于线粒体全序列的进化分析
线粒体基因组（mtDNA）为闭合双链环状DNA，长度一般在15.7-19.5kb。鱼类mtDNA的长度大多在15-18kb，其包含22个tRNA、13个编码蛋白质基因、2个rRNA和1个非编
码区。大多数脊椎动物mtDNA的组成相对较为稳定，但不同种群其基因组在结构和基因排列顺序上存在差异，这种差异性可能反映了真核细胞的不同进化路线
［6］
。自20世纪80年
代以来，mtDNA因具有结构简单、呈母系遗传、进化速度快以及在世代遗传中不会发生重组等特点而成为分子系统学的研究热点，被广泛用于生物间系统起源、分类及系统发育研究
［7-9］
。
2.2基于细胞色素b基因片段序列研究
动物线粒体DNA(mtDNA)由于结构简单、严格的母系遗传、几乎不发生重组、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点,已成为研究动物起源进化、群体遗传、系统发育等的重要标记. 其中, 细胞色素b(cytochrome b, 简称Cytb)基因的结构和功能在mtDNA的13 个蛋白质编码基因中被了解的最清楚[10], 且进化速度适中, 尤其适合种属水平的系统发育关系的研究, 被认为是解决分类及系统进化问题最可信的分子标记之一[11], 也是目前为止在鱼类分子进化研究中最常用的标记之一[12-15]。 2.3短散在核重复序列SINEs在鱼类系统进化的研究 2.3.1 SINEs是返转座子
在30多年DNA复性动力学的研究中，使DNA序列信息产生了前所没有的波澜。特别随着人类基因组计划的研究，非常惊人的揭示出:在高等真核生物基因组中，编码蛋白序列的核普酸仅占5%，其余序列都是大量无明显功能的重复序列（repeat sequences ) [16]。现在一般把基因组序列分为三部分:一是单拷贝的序列(unique sequence)，它们只有一个或两个拷贝，主要编码细胞内的蛋白;二是中等重复序列(moderate sequences)，拷贝数在103-5之间;在基因组内没有特定区域，而是分散在整个基因组内;它们也可以随着DNA转录而形成带有发卡结构的RNA。三是高度重复序列(high repeats)，它们的拷贝数在106以上。调控作用的表现。在人类染色体中，至少有30%的重复序列是由短散在核重复序列(short interspersed elements SINEs)和长散在核重复序列(long interspersedelements LINES)组成[17]。在植物中也有相似的发现，比如玉米，拟南芥中有50%这样的序列[18]。这一戏剧性的发现，强调重复序列不仅是基因组变异的进化代表，而且也预示了它可作为系统发育信息的潜在资源。 2.3.2SINEs的返转座机理
所有返转座元件可分为两大类:1自主性返转座元件;2非自主性返转座元件。而SINEs就是非自主性返转座元件的一个重要成员，它不能编码返转座时所需要的反转录酶和核酸内切酶，必须借助细胞内相应酶系来完成自身的返转座过程[19]。大量实验证明，有两个信息暗示了SINEs在返转座过程中依靠LINES的扩增:一是SINEs和LINES有相同3’端的序列
结构;二是LINES有SINEs两种典型的特征，就是3’端富含E的序列和可变的正向重复序列，而且SINEs的正向重复序列和L1家族返转座元件内切酶的识别位点是相同的[20]。目前的研究，SINEs依靠LINES的转座也得到实验证实，这就是在鳗鲡基因组内鉴定的UnaL2和UnaSINEl[21]，通过人工构建的载体，在体外成功演示了UnaSINE的返转座必须要有UnaL2的转座酶。相似的结果在人类基因组内也得到了证实[22]。 2.3.3 SINEs在鱼类中的研究
尽管SINEs的报道非常多，但有关SINEs在鱼类中的研究并不是很多，而且现有的报道也仅存在几个典型的代表种内，现根据文献的报道，有关SINEs在鱼类中的研究作一总结。
有关鱼类基因组内第一个SINEs的发现是在1986年，利用大马哈鱼(salmon )基因组在HeLa细胞抽提液中进行转录，标定转录物杂交文库，阳性克隆测序后，分离到由赖氨酸tRNA衍生的SINEs[23]。 尽管斑马鱼是一种模式生物，很早用于研究脊椎动物的发育模式;但斑马鱼基因组内第一个SINEs的报道却是在1996年[24]。该SINEs被定义为DANA，共有两个家族，DANA-16和DANA-m 1。AFC家族的SINEs是Okada研究组在非洲鲡鱼基因组内首次分离的第一个SINEs家族，该家族长度在320bp左右，具有SINEs的所有特征，通过点杂交分析，在基因组的含量为2X 103一4拷贝，并鉴定到4个部落的物种中[25]。目前有关鳗鲡基因组内SINEs较少。2002年，在鳗鲡基因组内成功的得到了LINES和SINEs，就是前面提到的UnaL2和UnaSINE 1，最为重要的是在体外培养的细胞中，该研究组成功展示了UnaL2介导UnaSINE 1的转座过程，开辟了SINEs机理研究史上的第三次飞跃。在此基础上，该研究组还在2005年，从该物种基因组内又分离到UnaSINE2，同时也证实UnaL2能够介导它的转座，并分析了UnaL2, UnaSINEl和UnaSINE2的J‘端尾巴序列，它们具有很高的同源性，为SINEs活性依赖于LINES的理论提供了可靠的实验证据[26]。 2.3.4反向PCR分离SINEs方法的建立
分离SINEs有好多种方法，但这些方法存在一些共同的缺点:1工作量大，如Kramerov和Bennett建立的方法[27]，要分离mRNA，构建基因组文库，反复克隆测序等;2涉及的技术多，程序多，比较容易出错，如Okada建立的体外转录方法分离SINEs[28]，需要培养细胞，抽提细胞核，整个基因组的体外转录，再构建基因组文库，杂交等，非常繁琐;尽管Borodulina创建了A-B PCR的方法简化了分离SINEs的方法，但该方法还需要构建基因组文库，利用标定的探针杂交来筛选SINEs，其工作量也很大。
在1988年，Ochman等人创立了反向PCR技术(Inverse PCR)，该技术主要是扩增己知序